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山梨醇对凡纳滨对虾无水运输代谢影响

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摘要:将驯化后体质量(12.86±0.80)g的凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)随机分为两组,分别在13℃的3.5%山梨醇溶液或清水(对照)中浸泡3min,至全部对虾侧卧水底呈休眠状态后,取30只一组装入聚氯乙烯(polyvinylchloride,PVC)袋(220mm×320mm),充纯氧后密封,置于15℃的恒温箱中无水运输。10小时后将全部对虾转移至的清水(20℃~25℃)中复苏。测定休眠5、10h和复苏1h状态下凡纳滨对虾血清血蓝蛋白、乳酸、葡萄糖浓度、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)、肝胰腺琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase,SDH)活力和肝糖原含量的变化,以探究山梨醇对凡纳滨对虾无水运输存活率的影响及其作用机理。结果发现,模拟无水运输10小时后,山梨醇组对虾存活率为88.89%,显著高于对照组(71.11%)(P<0.05);休眠状态下,山梨醇组血蓝蛋白、乳酸、血糖浓度和SDH、LDH活力显著高于对照组(P<0.05),肝糖原浓度显著低于对照组(P<0.05);复苏1小时后,两组对虾的乳酸、血糖浓度及对照组SDH活力仍与新鲜状态差异显著(P<0.05),其他参数恢复正常水平。结果表明,3.5%山梨醇可提高对虾有氧和无氧呼吸强度及存活率,缓解低、缺氧和能量不足的胁迫。

关键词:凡纳滨对虾;无水运输;呼吸代谢;能量代谢;山梨醇

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)(又称南美白对虾)营养丰富,肉质鲜美,是我国最主要的养殖虾类。2016年我国养殖凡纳滨对虾总产量超过93万吨,比2015年增长4.38%[1]。我国地域广阔,水产品运输耗时长,保活难度大。目前市场鲜活鱼虾等水产的运输方式主要为有水运输,受季节、温度、运输距离影响较大,运输的成本高、效率低[2]。采用无水运输可以减轻运输重量,减少容器体积,有效降低运输成本,特别适用于快递和航空运输[3]。无水运输时,水产品暴露在空气和低温环境中,受到刺激和胁迫产生应激反应[4-5]。短暂的应激很快能恢复,但长期的应激会损伤机体的免疫、代谢系统,甚至危害健康,导致死亡,更影响水产品的品质。目前,缓解水产运输应激的方法主要为麻醉处理,比如用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸(3-Aminobenzoicacidethylestermethanesulfonate,MS-222)[6-7]、丁香酚[8]和CO2[9]等,但这些方法存在药物剂量难以控制,有残毒等弊端。不同甲壳动物的形态结构和生理代谢调节功能不同,在无水条件下存活时间差异很大。有研究表明,相比多数甲壳动物,有些蟹类在无水的条件下可以存活更长时间,这与它们的体型和鳃结构的进化密不可分[10]。这些蟹的鳃和甲壳的结构能够有效防止水分蒸发,保持鳃的湿润,使其在空气中依然可以正常获取氧气[11-12]。山梨醇是一种由葡萄糖还原生成的小分子糖醇,易溶于水,水溶液为透明黏稠的液体。山梨醇的分子结构中含有亲水基团羟基,具有一定的吸湿性。前期研究表明,3.5%山梨醇溶液浸泡处理可以有效提高凡纳滨对虾的无水存活率。本试验分析凡纳滨对虾在模拟无水保活运输中血清和肝胰腺生理生化变化规律,重点从呼吸和能量代谢的角度研究山梨醇对凡纳滨对虾的影响,为有效减缓凡纳滨对虾的应激胁迫伤害,提高无水保活运输效率。

1材料与方法

1.1材料与试剂凡纳滨对虾购于杭州市萧山乔四养殖场,体质量(12.86±0.80)g,体长(13.94±2.55)cm。试验前连续充气暂养12h[水温(18±2)℃,盐度35g/L],弃用死虾和活力差的虾。山梨醇、三羟甲基氨基甲烷(Tris,分析纯):阿拉丁试剂(上海)有限公司;氯化钠、乙二胺四乙酸二钠二水合物(EDTA-2Na-2H2O)、蔗糖、盐酸(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;琥珀酸脱氢酶(succinatede-hydrogenase,SDH)试剂盒、血清乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)试剂盒、乳酸试剂盒、肝糖原试剂盒:南京建成生物工程研究所。

1.2仪器与设备722E型可见分光光度计:上海光谱仪器有限公司;MB16-414酶标仪:美国伯腾仪器有限公司;S-20氧气泵:浙江宁波赛尔电气有限公司;氧气罐:杭州电化集团燃气有限公司;M10557全自动气调包装机:北京中西远大科技有限公司;CPIIO2/CO2气体分析仪:丹麦丹圣(上海)贸易有限公司。

1.3方法凡纳滨对虾随机分为试验组和对照组,每组30尾对虾,设置4个平行。分别在13℃的3.5%山梨醇溶液或清水(对照)中浸泡(冷击)3min,至全部对虾侧卧水底呈休眠状态。休眠的对虾每30只一组装入聚氯乙烯(polyvinylchloride,PVC)袋(220mm×320mm)充纯氧后密封,置于恒温箱(15℃)中模拟无水运输。10h后将全部对虾转移至20℃~25℃的清水中复苏至能够游动。

1.4取样与指标测定血淋巴采集及血清的制备:用吸水纸吸干对虾体表水分,用一次性1mL无菌注射器从对虾的头胸甲与第一腹节间插入至心脏抽取血淋巴,每10只对虾的血淋巴合并,注入1.5mL离心管中。4℃静置过夜后于4℃、800×g离心10min,去除血细胞,取上层清液即为血清,分装并储存于-80℃冰箱中,用于测定血蓝蛋白、乳酸和血糖含量及LDH活力。肝胰腺采集以及匀浆制备:用吸水纸吸干对虾体表水分,在冰盘上迅速解剖取出肝胰腺,用少量冰冷的生理盐水(0.86%)漂洗去除血液,滤纸吸干水分后放入1.5mL离心管中,迅速放入液氮中,保存于-80℃冰箱中待测。取解冻的肝胰腺0.2g~1.0g至小烧杯,加入9倍肝胰腺重量的预冷匀浆介质(pH7.4,0.01mol/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖,0.8%氯化钠溶液)。冰浴下用均浆机研磨制成10%组织匀浆(匀浆时间10s/次,间隙30s,连续3次~5次)。取匀浆在4℃以3000r/min~5000r/min离心10min~15min,弃沉淀,取上清液测定SDH活力和肝糖原含量。SDH和LDH的活力、乳酸、肝糖原浓度采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。血糖送样至浙江大学动物科学学院附属医院检测。血浆血蓝蛋白含量的测定参考Nickerson等[13]的方法并加以改进[14]。取解冻的血清样品10μL加入990μL磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline,PBS)混匀,充分震荡,避免产生气泡,在波长334nm处测量其吸光度。以PBS缓冲液为空白对照。血蓝蛋白浓度用下式计算:E334nm(mg/mL)=2.30×OD334nm×1001.5数据处理试验数据均以平均值±标准误(mean±SE)表示,采用SPSS18.0统计软件进行分析,用Duncan氏检验进行多重比较,以P<0.05作为差异显著水平。

2结果与分析

2.1凡纳滨对虾无水运输的存活率模拟无水运输10小时后,山梨醇组对虾的存活率为88.89%,对照组为71.11%,山梨醇浸泡显著提高了凡纳滨对虾无水运输的存活率(P>0.05)。

2.2凡纳滨对虾琥珀酸脱氢酶活力和血蓝蛋白含量的变化无水运输过程中凡纳滨对虾肝胰腺琥珀酸脱氢酶SDH活力和血清血蓝蛋白含量的变化见图1。由图1(A)可知,短时低温刺激后,山梨醇组和对照组间SDH活力差异不显著(P>0.05)。对虾休眠10小时内,各组SDH活力逐渐下降;休眠5h,山梨醇组SDH活力由新鲜状态的3.556U/mgprot降低至2.588U/mgprot,显著高于对照组的1.482U/mgprot(P<0.05);休眠10h,山梨醇组SDH活力虽继续降低,但仍高于对照组,两组间差异不显著(P>0.05)。复苏1h后,山梨醇组SDH活力恢复至正常状态,对照组SDH活力未完全恢复,仍低于新鲜水平。凡纳滨对虾血清血蓝蛋白含量变化如图1(B)所示。新鲜状态下凡纳滨对虾的血清血蓝蛋白含量为17.85mg/mL;低温冷击后,两组血蓝蛋白含量都显著升高(P<0.05),但组间无显著差异(P>0.05)。休眠过程中,凡纳滨对虾血清血蓝蛋白含量继续升高,并保持在较高水平。休眠5h,山梨醇组血蓝蛋白含量显著高于对照组(P<0.05);休眠10h两组血蓝蛋白含量无显著差异(P>0.05);复苏1小时后,两组血蓝蛋白含量下降,均恢复到正常水平。

2.3凡纳滨对虾乳酸脱氢酶活力和乳酸浓度的变化山梨醇对模拟无水运输过程中对虾血清LDH活力和乳酸浓度的影响见图2。由图2可知,低温冷击后,两组对虾LDH活力都显著升高(P<0.05),乳酸浓度升高但变化不显著(P>0.05);休眠5h,LDH保持升高趋势,山梨醇组LDH活力显著高于对照组(P<0.05);休眠10h,山梨醇组和对照组LDH活力略有下降,但仍为新鲜状态的2.63倍和2.59倍。休眠过程中对虾血清乳酸浓度不断上升,第10小时达到最大值,山梨醇组乳酸浓度为2.70mmol/L,显著高于对照组(2.08mmol/L)(P<0.05)。在常温清水中复苏1小时后,两组对虾LDH活力恢复到正常状态,乳酸浓度略有下降但仍高于新鲜水平。整个模拟运输过程中,乳酸浓度的变化比LDH活力变化滞后。

2.4凡纳滨对虾血糖浓度和肝糖原含量的变化无水保活运输过程中凡纳滨对虾血清葡萄糖浓度和肝糖原含量的变化见图3。从图3(A)可以看出,无水运输过程中凡纳滨对虾的血糖浓度先升高后下降。新鲜状态和短时冷击后凡纳滨对虾的血糖浓度无显著差异(P>0.05);休眠5h血糖浓度升高,山梨醇组血糖浓度为对照组的69.5%,显著低于对照组(P<0.05);休眠10h对虾血糖浓度降低,接近正常水平,山梨醇组仍显著低于对照组(P<0.05)。凡纳滨对虾肝糖原含量的变化见图3(B)。新鲜状态时,对虾的肝糖原含量为5.419mg/g,冷击和休眠状态时对虾肝糖原含量下降,始终低于新鲜水平。休眠5h和10h,山梨醇组肝糖原含量均显著低于对照组(P<0.05)。恢复1小时后,两组对虾肝糖原含量均回升,基本恢复正常状态。

3讨论

3.1山梨醇对呼吸代谢的影响SDH是三羧酸循环的第一个脱氢酶,是有氧呼吸的标志酶。鳃要与水直接接触才能发挥呼吸功能[15]。无水运输过程中凡纳滨对虾暴露于空气中,会损伤鳃上皮细胞等鳃结构,扰乱对虾正常摄取氧气,造成缺氧胁迫。缺氧可调节对虾体内酶活力,使对虾的主要代谢形式由有氧代谢转变为无氧代谢[16],还会刺激机体产生活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS),引起氧化应激损伤细胞[17]。无水运输过程中,凡纳滨对虾在休眠的10小时内,山梨醇组SDH活力始终高于对照组,推测这一阶段山梨醇组对虾有氧呼吸强度高,机体对氧气摄取、运输和利用的效率更高。LDH是生物细胞质内无氧呼吸的关键酶[18],调节乳酸和丙酮酸的相互转化参与能量代谢。乳酸是无氧代谢的终产物[19],其含量常被用于评价动物的无氧代谢[20]。Maruo等[21]的研究表明,受到缺氧胁迫的罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)氧气消耗量降低,血淋巴内乳酸和CO2积累。试验中对虾休眠过程中,山梨醇组LDH活力和乳酸含量均高于对照组,说明此时对虾无氧呼吸加速进行,代谢终产物在血液中积累。有研究发现甲壳动物从无水环境回到水环境时需要经历一个适应过程。这与试验两组对虾复苏1小时后,LDH活力恢复到正常状态,乳酸浓度略有下降但仍高于新鲜水平这一结论相符。对照组SDH活力在回到正常水环境后恢复缓慢、LDH活力在休眠过程中始终低于山梨醇组,可能是由于缺氧胁迫严重导致了部分细胞结构受损。凡纳滨对虾最终可能因鳃功能异常无法充分利用溶解氧,使代谢受阻,细胞内离子代谢紊乱,破坏细胞膜等结构而触发细胞凋亡,导致对虾死亡[22]。

3.2山梨醇对能量代谢的影响无水运输过程中低温和缺氧胁迫引起凡纳滨对虾生理代谢紊乱,造成供能不足[22]。缺氧条件下,LDH催化丙酮酸还原生成乳酸和少量能量。Holman等[23]发现,美人虾(Lepidophthalmuslouisianensis)在缺氧的情况下能通过提高无氧代谢的强度,增加三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)的合成以满足机体对能量的需求。本试验中,山梨醇组在休眠状态时SDH活力虽高于对照组,但低于新鲜状态,有氧代谢产能可能不足以维持对虾的代谢消耗。环境胁迫刺激凡纳滨对虾进行无氧代谢,生成的ATP能在一定程度上弥补因有氧代谢强度降低所导致的能量短缺[17]。山梨醇组的有氧呼吸和无氧呼吸强度高,意味着机体产生更多能量用于维持基本的代谢和其他生命活动,并有利于抵抗环境中持续出现的胁迫。血蓝蛋白是甲壳动物血液中协助运输氧的主要呼吸蛋白,占血淋巴总蛋白含量的60%~95%[24]。缺氧时加速合成血蓝蛋白是甲壳动物的一种生理代偿机制[25]。试验中,凡纳滨对虾休眠过程中,两组对虾的血蓝蛋白含量都呈上升趋势,这与Taylor等[26]对无脊椎动物血蓝蛋白动态变化的实验结论,缺氧会加速血蓝蛋白的合成一致。Cheng等[27]对罗氏沼虾(Macro-brachiumrosenbergii)的研究指出环境氧浓度降低时,储存在罗氏沼虾肝胰腺囊泡中的预蛋白在ATP协助下迅速合成血蓝蛋白,血蓝蛋白含量及其氧亲和力提高能增强机体对氧气的吸收和利用能力[28]。Paschke等[29]关于捕蟹(Lithodessantolla)在低溶解氧下代谢的研究表示,捕蟹是通过调节氧合血蓝蛋白的含量和激活无氧代谢,来加强自身对低氧环境的适应能力。试验中,山梨醇组对虾呼吸代谢加强,加速ATP的生成。其中一部分ATP可能用于血蓝蛋白的合成,进而增加血淋巴的氧容量,提高对虾对氧气的利用率,又在一定程度上促进有氧呼吸,形成良性循环的调节机制。葡萄糖是甲壳动物一般代谢过程中主要的能量底物,有氧条件下,机体通过三羧酸循环氧化分解葡萄糖释放大量能量。动物体内的糖类水平可以用于分析动物的能量代谢[30],血糖浓度可于评价动物体所受生理应激的强度[4]。低温或缺氧等刺激容易导致动物血液内葡萄糖含量快速升高[31]。Padinhare等[6]关于观赏鱼(Puntiusfilamentosus)的研究表明,运输过程中低死亡率处理组的鱼血糖浓度相对较低,表明该过程中鱼体受到周围环境的胁迫较小。根据Webster[32]的研究,黄道蟹(Cancerpagurus)血淋巴内高血糖激素含量在其暴露于空气的前1h~4h会迅速升高,造成症急性缺氧和高血糖等胁迫。本试验模拟运输的过程中,山梨醇组对虾的血糖浓度始终低于对照组,且变化幅度更为平稳,没有出现血糖过高的情况,说明该组受到的应激胁迫较小,对氧气的利用率提高,缺氧胁迫得到缓解。肝糖原在短期储存和维持葡萄糖水平中有重要的作用[33]。Axelrod等[34]关于应激激素的研究表明,在无水过程中温度和氧气含量等环境因素改变,会调节机体分泌激素,分解肝糖原,使血糖浓度升高。储藏在肝胰腺的能量可以转移到动物体内其他组织用于生长和繁殖[35]。本试验中凡纳滨对虾血糖浓度先增后降,肝糖原含量持续降低,可能是凡纳滨对虾受到低温和缺氧刺激前期,动用肝糖原,以葡萄糖的形式释放至血液中为机体供能。休眠后期,对虾血糖浓度降低,可能是缺氧胁迫加剧,机体主要通过无氧代谢供能,血液中葡萄糖大量消耗所致。

4结论

山梨醇具有吸水保湿性,可以降低凡纳滨对虾体表液体的表面张力,有助于增加液体的扩散和滞留。在长时间无水过程中,山梨醇有助于保持凡纳滨对虾体表和鳃的湿润,一定程度减少鳃丝等组织的失水损伤,保持呼吸上皮细胞的基本结构和功能。降低鳃损伤程度有利于对虾维持一定强度的气体交换,提高血淋巴中的氧浓度,促进细胞中线粒体参与有氧代谢,为机体提供能量。山梨醇处理使凡纳滨对虾的呼吸和能量代谢更加充分,减少机体因缺氧和能量不足造成的代谢紊乱及细胞损伤,加强应对无水和低温胁迫的能力,提高凡纳滨对虾无水运输的存活率。

作者:查蒙 管维良 茅林春 单位:浙江大学

食品与生物技术学报责任编辑:张雨    阅读:人次
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