牛磺熊去氧胆酸有关物质的合成范文

《化学试剂杂志》2016年第一期

摘要:

为加强对牛磺熊去氧胆酸原料药和制剂产品的质量控制，合成了可能存在的两个有关物质:牛磺鹅去氧胆酸和牛磺石胆酸，结构经1HNMR和MS确证，并通过高效液相色谱仪建立了牛磺熊去氧胆酸有关物质的分析方法，可为化学药的仿制研究及其原料药与制剂的质量控制提供依据和参考。

关键词:

牛磺熊去氧胆酸;有关物质;合成;结构确证

牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholicacid)(1)，化学名为2-{［(3，5)-3，7-二羟基-24-氧代胆甾烷-24-基］氨基}乙烷磺酸二水合物，结构式如下所示。由意大利贝思迪大药厂(BruschettiniS.R.I.)研制，1991年首次在意大利上市，2007年以商品名滔罗特(Taurolite)获准在中国销售，临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。卓超等［1，2］报道，牛磺熊去氧胆酸的合成均以熊去氧胆酸为原料来进行。中国药典(2015版)对熊去氧胆酸质量规定中，要求控制鹅去氧胆酸、石胆酸的含量。在制备牛磺熊去氧胆酸过程中，原料熊去氧胆酸中若含有鹅去氧胆酸和石胆酸，会生成对应的牛磺鹅去氧胆酸和牛磺石胆酸。为了对牛磺熊去氧胆酸原料药及制剂进行质量控制，需要制备与其有关物质作为对照品。Venturoni等［3］以鹅去氧胆酸为原料，使用2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)作为缩合试剂来合成牛磺鹅去氧胆酸钠，产率93%。邓勇等［4］使用2，2'-二硫二吡啶、2，2'-二硫二苯并噻唑或胱胺类化合物合成活性硫酯，再用牛磺酸胺解制备牛磺鹅去氧胆酸和牛磺石胆酸，产率为76%～85%。上述方法或存在试剂价格昂贵(如EEDQ)，或存在二硫化试剂的使用易造成后处理繁琐且产品收率及纯度很难提高等问题。本研究参考文献［5-9］对合成方法进行改进，以鹅去氧胆酸(1)为原料，在三乙胺作用下与氯甲酸异丁酯反应形成混酐，后在碱性条件下与牛磺酸反应形成牛磺鹅去氧胆酸钠，用盐酸酸化后制得牛磺鹅去氧胆酸(有关物质A)，重结晶后收率为92%。参照牛磺鹅去氧胆酸的合成，以石胆酸(2)为原料制得了牛磺石胆酸(有关物质B)，收率93%，合成路线如下所示。并建立了一种用于有关物质纯度检测的HPLC分析方法，经检测有关物质A和B的纯度均在98.5%以上。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂Mercury400型核磁共振仪(美国Varian公司);电喷雾三重四级质谱仪(美国Waters公司);TektronixX-4型熔点仪(温度计未经校正，北京泰克仪器有限公司);Agilent1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司);鲁道夫I型旋光仪(美国鲁道夫公司)。牛磺熊去氧胆酸对照品(编号110846-200506，中国药品生物制品检定所);其他试剂均为分析纯。

1.2合成方法

1.2.1牛磺鹅去氧胆酸的合成于100mL圆底烧瓶中加入10.0g(25.5mmol)鹅去氧胆酸和60mL丙酮，搅拌溶解后冰水浴降温至0℃，然后加入3.1g(30.6mmol)三乙胺，控制内温0～5℃，滴加3.85g(28.1mmol)氯甲酸异丁酯。滴加完毕，室温搅拌，TLC检测反应至结束，抽滤，得鹅去氧胆酸活性酸酐滤液待用。将1.3g(30.5mmol)氢氧化钠溶解在30mL水中，加入3.19g(25.5mmol)牛磺酸，继续搅拌30min后，将其滴加到上述鹅去氧胆酸活性酸酐的滤液中，室温反应5h。反应毕，减压蒸除丙酮。瓶内剩余物，用5%盐酸调至pH3～4，乙酸乙酯萃取(30mL×3)。水相搅拌下缓慢加入5mL浓盐酸酸化，20℃下搅拌16h，抽滤，滤饼50℃减压干燥，得牛磺鹅去氧胆酸粗品(约12.5g)，收率98%。

1.2.2牛磺石胆酸的合成以5.0g(13.3mmol)石胆酸和1.6g(16.0mmol)三乙胺、2.0g(14.6mmol)氯甲酸异丁酯、1.62g(13.3mmol)牛磺酸为原料，按照有关物质A的制备方法制，得6.0g白色固体，总收率93%，纯度98.7%(HPLC)，m.p．212～214℃，［α］20D=+27.5°(c=1.0，EtOH)［文献［3］值:m.p．210～212℃，［α］20D=+27.9°(c=1.0，EtOH)］。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)，δ:0.68(s，3H);0.91(s，3H);0.98(d，3H，J=4.2Hz);0.99～1.12(m，2H);1.20～1.60(m，15H);1.61～1.71(m，4H);1.81～1.86(m，2H);1.93～1.96(m，2H);2.07～2.18(m，2H);2.28～2.35(m，1H);3.05(t，2H，J=7.2Hz);3.45(m，1H);3.55(t，2H，J=7.2Hz)。ESI-MS，m/z(%):484.3［M+H］+。

1.3高效液相色谱检测方法牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和牛磺石胆酸，用流动相分别配制成0.5mg/mL供试液。混合液为分别取上述3个供试液等体积混合而成。色谱柱:WelchromC18柱(4.6mm×250mm，5μm);流动相:V(0.05mol/L磷酸二氢钾溶液)∶V(甲醇)=30∶70;检测波长:202nm;流速:1mL/min;柱温:30℃;进样量:5μL。

1.3.1高效液相色谱分析利用上述高效液相色谱检测方法对牛磺熊去氧胆酸对照品、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺石胆酸及混合样进行液相色谱分析，检测结果如图1、2所示。由图1、2可以看出，该分析方法用来作为牛磺熊去氧胆酸有关物质的检测方法可靠性高，3者混合样品分离效果好，可为牛磺熊去氧胆酸的仿制研究及其原料药与制剂的质量控制提供依据和参考。

2结果与讨论

2.1缩合剂的选择对反应收率的影响保持其他实验条件不变，分别使用氯甲酸乙酯、氯甲酸正丙酯、氯甲酸正丁酯、氯甲酸异丁酯作缩合剂，研究了不同缩合剂对反应收率的影响，实验结果见表1。由表1可以看出，当缩合剂选用氯甲酸乙酯、氯甲酸正丙酯和氯甲酸正丁酯时，由于其活性较高，底物分子中醇羟基可能与之反应生成副产物，导致总反应收率偏低;当选用氯甲酸异丁酯作为缩合剂时，其反应活性较低，能高选择性地发生反应，重结晶后总收率高达92%以上。

2.2物料物质的量比对反应收率的影响为考查形成活性酸酐过程中氯甲酸异丁酯用量对收率的影响，固定原料鹅去氧胆酸10.0g(25.5mmol)、三乙胺3.1g(30.6mmol)、60mL丙酮，改变氯甲酸异丁酯的投料量，实验结果见表2。由表2可以看出，随着氯甲酸异丁酯与鹅去氧胆酸物质的量比的增大，收率明显增大，当n(原料)∶n(氯甲酸异丁酯)≥1∶1.2时，收率降低。故选用鹅去氧胆酸与氯甲酸异丁酯的物质的量比为1∶1.1。

2.3溶剂种类对反应收率的影响保持其他实验条件不变，本实验分别选用二氧六环、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂，研究了不同溶剂对产物收率的影响，结果如表3所示。采用二氧六环作为反应溶剂时，从TLC结果可知生成活性酸酐的纯度较差，进而导致反应收率较低;选用N，N-二甲基甲酰胺作为反应溶剂，总反应收率较高，但后处理过程中需蒸出高沸点的N，N-二甲基甲酰胺;选用丙酮作为反应溶剂时，生成活性酸酐纯度高，经胺解转化为产物收率高达92%以上，同时其沸点低，易蒸馏出来循环使用。

2.4温度的影响保持其他实验条件不变，本实验研究了不同反应温度对产物收率的影响。从表4可以看出，当反应温度维持在10℃时，活性酸酐的胺解进行较慢，可能有部分活性酸酐在碱性条件下发生水解重新变为原料，而无法生成产物;反应温度在30℃时，胺解反应进行顺利，收率较高;反应温度在50℃时，反应收率较低，可能的原因是温度较高、活性酸酐水解加快，不利于产物的形成。因此选择30℃作为最佳反应温度。

3结论

本研究分别以鹅去氧胆酸与石胆酸为原料，选用氯甲酸异丁酯作为缩合剂，经过两步反应以高产率制得有关物质牛磺鹅去氧胆酸和牛磺石胆酸，并建立了相关液相分析方法，可应用于牛磺熊去氧胆酸的仿制研究及其原料药与制剂的质量控制中。

参考文献:

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作者：李永 曹俊 金幸 朱高峰 王建塔 汤磊 单位：贵州医科大学 药学院 上海慈瑞医药科技有限公司