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尿液中卡那霉素的直接测定

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《分析科学学报》2016年第二期

摘要:

基于卡那霉素对CdTe量子点荧光的增强效应,建立一种直接测定尿液中卡那霉素含量的同步荧光光谱法。研究发现采用同步荧光光谱法,能够有效避免尿液中复杂基质的荧光干扰。在优化实验条件下,卡那霉素浓度在0.2~20.0μg/mL范围内与体系相对同步荧光强度呈良好的线性关系,相关系数为0.9996,检出限为0.005μg/mL。该方法用于尿液样品中卡那霉素含量的直接测定,回收率为96.3%~104.4%。

关键词:

卡那霉素;CdTe量子点;同步荧光光谱法;直接测定

卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素,对革兰阴性菌及耐药性金黄色葡萄菌具有良好的抗菌活性,临床上主要用于治疗敏感菌所致的肺部感染、尿路感染、胆道感染及腹腔感染等。但过量使用卡那霉素,易对人体健康造成严重危害,因此必须严格监控其使用[1]。目前卡那霉素的测定方法主要有紫外分光光度法、液相色谱法、酶联免疫吸附法等[2-4]。其中,紫外分光光度法操作简便但灵敏度较低,液相色谱法灵敏度较高但前处理程序复杂且仪器昂贵,酶联免疫吸附法简便易行但存在交叉反应等,因此建立一种简便、直接和灵敏的卡那霉素含量测定方法,对于指导合理安全用药具有重要的临床意义。与传统有机染料相比,量子点具有激发光谱宽、发射光谱窄而对称、尺寸可调和光化学性质稳定等优点。近年来以量子点为荧光探针建立的荧光光谱法,已广泛用于离子、生物大分子和生化药物等分析检测中[5-7]。因尿液中复杂基质的荧光干扰,常规荧光光谱法难以实现尿液中卡那霉素含量的直接测定。而同步荧光光谱法不仅能够有效避免复杂基质的荧光干扰,也具有简化谱图、提高选择性和减少光散射干扰等特点,已经得到广泛应用[8,9]。本文采用同步荧光光谱法,通过选择合适的波长差,有效避免尿液中复杂基质的荧光干扰。基于卡那霉素对CdTe量子点荧光的增强效应,建立一种同步荧光光谱法直接测定尿样中卡那霉素含量的新方法。该方法操作简便、稳定性好及灵敏度高,直接用于尿液样品中卡那霉素含量的快速测定,结果满意。

1实验部分

1.1仪器与试剂F-4500荧光分光光度计(日本,日立公司);U-3310紫外-可见分光光度计(日本,日立公司);pHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司);90-3恒温双向磁力搅拌器(上海振荣科学仪器有限公司);3-30K高速台式冷冻离心机(德国西格玛有限公司)。1.0mg/mL卡那霉素标准溶液:准确称取50mg卡那霉素(KANA,中国药品生物制品检定所),蒸馏水溶解后转移至50mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,用时稀释至所需浓度;0.1mol/L磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液和硼酸-硼砂缓冲液;碲粉、硼氢化钠、氯化镉、巯基乙酸和氢氧化钠。以上所有试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。

1.2CdTe量子点的制备参考文献方法[10]制备巯基乙酸修饰的CdTe量子点。准确称取160mg硼氢化钠和86mg碲粉置于反应瓶中,加入5mL蒸馏水溶解,冰水浴中还原反应8h,得到紫色碲氢化钠水溶液。在250mL三口烧瓶中加入286mg氯化镉,用100mL蒸馏水溶解,磁力搅拌下加入220μL巯基乙酸,用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值至11.0,通氮除氧30min后,剧烈搅拌下加入新制备的碲氢化钠水溶液,100℃水浴回流2h,得到1.0mmol/L巯基乙酸修饰的CdTe量子点溶液(以HTe-浓度计算)。

1.3卡那霉素的测定在5mL比色管中,依次加入0.5mL35μmol/LCdTe量子点溶液、0.5mL500mmol/LTris-HCl缓冲液(pH=7.5)及一定量的1.0mg/mL卡那霉素标准溶液,然后用蒸馏水稀释至刻度,摇匀。室温下放置10min后,在波长差△λ=230nm、激发和发射狭缝宽度均为5nm条件下,进行同步荧光光谱扫描,分别测定加入卡那霉素标准溶液前后体系的同步荧光强度F0和F,计算体系相对同步荧光强度△F=F-F0。

2结果与讨论

2.1荧光光谱特性分析人体尿液中含有多种有机物质,其中一些物质具有很强的荧光,图1为尿液和CdTe量子点的荧光光谱。从图1可知,采用常规荧光光谱法时,尿液中复杂基质的荧光光谱与CdTe量子点的荧光光谱重叠严重,从而对CdTe量子点的荧光强度有很大干扰,难以实现CdTe量子点对尿液中卡那霉素含量的直接测定。采用同步荧光光谱法,可避免尿液中复杂基质的荧光干扰,而波长差直接影响其选择性和灵敏度。在不同波长差△λ条件下,分别测定尿液、CdTe量子点及卡那霉素-CdTe量子点-尿液体系的同步荧光光谱。结果发现,当波长差△λ=230nm时,CdTe量子点同步荧光峰位于334nm处,而尿液中复杂基质同步荧光峰位于228nm处,此时二者重叠较少,从而避免尿液中复杂基质对CdTe量子点同步荧光强度的干扰;同时当卡那霉素加入CdTe量子点-尿液体系后,体系同步荧光峰位不变,但卡那霉素对CdTe量子点同步荧光的增强效应最大(见图2)。因此实验选择波长差△λ=230nm测定体系的同步荧光强度。

2.2pH值的选择考察Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和硼酸-硼砂缓冲液对体系相对同步荧光强度△F的影响,结果发现在Tris-HCl缓冲液中,△F最大且相对稳定。同时,考察Tris-HCl缓冲液pH值对体系相对同步荧光强度△F的影响,结果发现随着Tris-HCl缓冲液pH值的增加,△F先增大后减小;当pH值为7.5时,△F达到最大值。因此实验选择加入pH值7.5的Tris-HCl缓冲液。

2.3CdTe量子点浓度的选择考察CdTe量子点浓度对体系相对同步荧光强度△F的影响,结果如图3所示。由图3可知,随着CdTe量子点浓度的增加,△F逐渐增大;当CdTe量子点浓度为3.5μmol/L时,△F达到最大值;继续增大其浓度,△F反而逐渐降低。考虑到灵敏度和信噪比,实验选择CdTe量子点浓度为3.5μmol/L。2.4反应时间及稳定性的选择考察反应时间对体系相对同步荧光强度△F的影响。结果表明,CdTe量子点与卡那霉素反应10min后,△F达到稳定,且在30min内保持不变。因此实验选择10min后测定体系的相对同步荧光强度。2.5方法的线性范围及检出限在优化实验条件下,CdTe量子点溶液中加入Tris-HCl缓冲液及一系列浓度的卡那霉素标准溶液,按实验方法测定CdTe量子点的同步荧光光谱,并以卡那霉素浓度对体系相对同步荧光强度△F绘制工作曲线,结果如图4所示。由图4可知,卡那霉素浓度在0.2~20.0μg/mL范围内与△F呈良好的线性关系,回归方程为:△F=0.69148+3.15729c,相关系数为0.9996。根据IUPAC的规定,以3S0/S计算出此方法的检出限为0.005μg/mL。2.6实际样品的测定取肌肉注射200mg卡那霉素健康受试者1h(1#)和4h(2#)的尿液样品,8000r/min离心10min,取上清液置于50mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度。按实验方法测定尿液样品的同步荧光强度,同时进行加标回收实验,结果如表1所示。由表1可知,加标回收率在96.3%~104.4%之间,相对标准偏差(RSD)为1.6%~2.4%,表明该方法可用于尿液样品中卡那霉素含量的直接测定。

3结论

采用同步荧光光谱法,通过选择合适的波长差△λ=230nm,从而避免尿液中复杂基质的荧光干扰。基于卡那霉素显著增强CdTe量子点的荧光强度,建立一种直接测定尿液中卡那霉素含量的同步荧光光谱法。在优化实验条件下,卡那霉素浓度在0.2~20.0μg/mL范围内与体系相对同步荧光强度呈良好线性关系,相关系数和检出限分别为0.9996和0.005μg/mL。该方法只需对尿液样品进行简单处理,即可实现尿液样品中卡那霉素含量的定量测定,有望成为卡那霉素含量的常规测定方法。

作者:毛永强 胡美娜 李娜 张丹 单位:辽宁工程技术大学理学院 辽宁工程技术大学安全科学与工程学院 矿山热动力灾害与防治教育部重点实验室

分析科学学报责任编辑:杨雪    阅读:人次
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