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多种雌激素残留的质谱分析

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《分析测试技术与仪器杂志》2016年第2期

摘要:

建立了同时测定7种雌激素残留的液相色谱-串联质谱法.在最优条件下,待测物呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.9957,检测限介于0.5000~50.00ng/mL范围.鱼肉组织经C18小柱净化浓缩,4.0mL乙腈-水(体积比5∶95,%)淋洗,2.0mL乙腈-水(体积比95∶5,%)洗脱.三类鱼肉样品中(鮦鱼、龙胆鱼、多宝鱼)均检出双酚A和己二烯雌酚,部分样品中检出雌二醇和雌酮,加标回收率为85.70%~120.9%.方法快速、准确,适用于水产品中雌激素多残留的高效测定.

关键词:

雌激素;固相萃取;液相色谱;串联质谱;水产品

雌激素是一类常见的内分泌干扰物,会扰乱机体内分泌物的正常生成、转化、代谢和结合,造成生物体免疫、生殖功能异常[1-2].近年来,避孕药和畜牧养殖用药使用量激增,在湖泊、河流、污水中均存在雌激素富集的现象,导致鱼类出现严重性畸形[3].对人类而言,雌激素通过食物链转移,进入人体可诱发儿童性早熟,对成人生育功能也有影响,尤其对女性影响最为明显,易造成流产、婴儿出生缺陷等问题,甚至诱发卵巢癌、乳腺癌等疾病[4-5].因此,雌激素对环境、生态和人类的影响备受关注,有必要建立灵敏、科学的方法分析雌激素.目前,雌激素多残留检测分析方法已有综述[6-7],主要包括气相色谱[8]、气相色谱-质谱联用法[9-10]、液相色谱法[11-12]、液相色谱-质谱联用[13-16]等.其中,液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)以选择性强、灵敏度高的特点,应用最广.四级杆飞行时间质谱(QTOF-MS)灵敏、分辨率高、特异性强,基于碰撞诱导解析和二级质谱功能,提供化合物的结构断裂原理,在雌激素等药物残留检测中具有良好的应用前景.

1试验部分

1.1仪器与试剂

1200系列液相色谱-6520型四级杆飞行时间串联质谱仪(Agilent,USA);Milli-Q超纯水系统(Milipore,USA);7018-00固相萃取装置(JTBaker公司).雌三醇(E3)、双酚A(BPA)、雌二醇(E2)、2,4-二氯苯酚(2,4-dcp)、己二烯雌酚(DE)购自Sigma-aldrich公司,炔雌醇(EE)、雌酮(E1)购自德国DrEhrenstorferGmbh公司.乙腈为色谱纯(Sigma-aldrich公司),乙酸铵购自天津市福晨化学试剂厂,试验用水为超纯水.所有试剂使用前过滤.

1.2溶液配制及工作曲线绘制

标准溶液:准确称取适量标准品,乙醇溶解,配制成1000μg/mL储备液,4℃贮存.乙酸铵溶液:称取0.77g乙酸铵,定容至1000mL,稀释成5.0、1.0mmol/L溶液,用于后续试验.工作曲线绘制:混合标准母液用超纯水逐级稀释,获得一系列混标工作溶液.在最优条件下测定,根据峰面积与相应浓度的关系绘制工作曲线.

1.3液相色谱-质谱条件

色谱柱AgilentZorbaxSB-C18(Φ5μm,4.6×150mm);流动相为H2O(A)-乙腈(B)二元体系;梯度洗脱;流速0.4mL/min;进样量8μL;柱温35℃.质谱选择ESI(-)和多反应监测模式;干燥气温度350℃、流速10L/min;雾化气压力0.276MPa;毛细管电压3500V;碎裂电压140V;2GHz动态拓展采集模式;m/z100-310.试验所用气体为氮气(纯度>99.9%),碰撞气为高纯氮气(纯度>99.999%).

1.4样品处理

样品提取:鮦鱼、龙胆鱼、多宝鱼购自福州马尾水产品批发市场.鱼类去头、鳞、骨及内脏,取鱼肉组织,液氮中研磨成鱼粉.称取0.50g鱼粉,加入5.0mL乙腈,超声提取10min,10000r/min下离心10min,取上清液.残渣再用2.0mL乙腈重复提取,合并两次上清液.提取液用正己烷脱脂,每次用量3.0mL,重复操作二次,弃去正己烷,氮气吹干,用2.0mLH2O溶解待用.固相萃取(SPE):BondElut-C18小柱(200mg/3mL,Agilent公司)用3.0mL甲醇活化、3.0mL水平衡,提取液过柱,4.0mL乙腈-水(体积比5∶95,%)淋洗、2.0mL乙腈-水(体积比95∶5,%)洗脱,收集洗脱液,氮吹浓缩,H2O定容至1.0mL,过滤后供HPLC-MS分析.

2结果与讨论

2.1色谱流动相选择

选定ZorbaxSB-C18色谱柱(Φ5μm,150×4.6mm),考察乙腈-水、乙腈-1.0mmol/L乙酸铵及乙腈-5.0mmol/L乙酸铵作为流动相的效果,结果如图1(a)所示.试验结果表明,乙酸铵浓度增大,雌激素峰面积总体呈下降趋势.故采用乙腈-H2O为流动相,此时色谱峰响应高、分离效果理想.在分离复杂混合物时,梯度洗脱能提高分析效率、改善分离度.尝试了多种梯度方案对混合物分离的影响.结果发现,最优的梯度洗脱程序为:0~4.0min,维持65%B;4.0~4.1min,65%~97%B;4.1~8.0min,维持97%B;8.0~8.5min,97%~65%B,流速为0.4mL/min.在单次分析结束后,充分冲洗和平衡色谱柱.

2.2MS条件的优化

7种雌激素的化学结构式如图2所示,其结构中含有不同数量的羟基或氯原子,首选ESI(-)检测.为保证母离子良好的传输效率,优化了质谱碎裂电压的影响,如图1(b)所示.当碎裂电压介于140~150V之间,大部分物质的响应值基本恒定,故选取碎裂电压为140V.其他质谱参数的选择是为了改善喷雾效果和电离状况,提高方法的灵敏度.经优化,确定干燥气温度350℃,干燥气流速10L/min.最优条件下,待测物在8min内实现分离,且形成很强的[M-H]-母离子峰和明显的同位素峰(如图3所示).

2.3前处理方法探索

对比了两种C18小柱的萃取效果.结果发现,ProElut-C18小柱对E3和BPA的回收率不理想(低于50%).提取液经BondElut-C18小柱过柱,采用5%、10%、20%的乙腈-水溶液淋洗.乙腈含量越高,淋洗液的洗脱能力越强.5%乙腈-水淋洗时,后续检测杂质稍多,但利用质谱提取离子功能,目标物测定不受影响且回收率较高.考察乙腈质量分数在80%~100%的洗脱效果.当乙腈质量分数低于90%时,后续浓缩步骤耗时长、回收率不高;乙腈质量分数为95%时的洗脱效果与100%乙腈接近,因此选择95%乙腈将目标物洗脱.优化了洗脱液体积(1.0~3.0mL),发现用量为2.0mL时,目标物回收效果较好.因此,BondElut-C18小柱以4.0mL5%乙腈-水淋洗,2.0mL95%乙腈洗脱.相较于液液萃取,SPE法操作简便、节省有机溶剂.

2.4二级质谱解析

利用串联质谱对分析物进行结构分析(如图4所示).E2、E3、EE和E14种组分具有相同母核,形成共同的碎片离子峰m/z145.0637(或143.0491)、183.0798,上述物质的断裂原理与文献[17-18]相符.BPA苯环侧链上两个甲基空间位阻大,推测丢失—CH3、—C6H6O、—C3H4等自由基碎片.2,4-dcp对应的碎片离子m/z124.9776、89.0034为连续丢失—Cl所得.DE是苯二烯类化合物,分别形成[M-H-CH3]-.、[M-H-C3H6]-.、[C6H5O]-.等碎片.后3种物质的多级质谱断裂途径鲜见报道(如图5所示).

2.5方法验证

精确配制7种雌激素的系列标准混合液,考察线性关系,以3倍信噪比为检测限,结果如表1所列.方法的检测限为0.5000~50.00ng/mL,相关系数介于0.9957~0.9999范围内.以200ng/mL标准混合液(BPA40ng/mL,EE400ng/mL,其余组分为200ng/mL)进行精密度试验,连续5天进样,日间RSD小于9.074%,表明方法稳定且重现,适合于7种雌激素的定量分析.

2.6鱼肉样品分析

鱼肉样品中雌激素的计算公式为:Cx=Ci×V/m,其中,Ci为各化合物质量浓度(由标准曲线计算,ng/mL),V为样品处理最后定容的溶液体积(mL),m为鱼粉质量(g).试验发现,鱼肉样品基质复杂,虽经SPE净化,在质谱总离子流图中干扰峰仍较多.利用QTOF质谱的提取离子功能结合保留时间、精确质量数等信息,3种鱼肉中均检出BPA和DE,部分样品检出E2和E1残留(如表2所列).向龙胆鱼样品添加两个不同质量浓度的目标物,每个水平测定3份样,计算回收率(如表3所列).由表3可得,目标物回收率大于85.70%,RSD为0.8370%~3.568%,表明方法可靠,满足分析检测的要求.

3结论

建立了固相萃取-液相色谱-串联质谱快速测定7种雌激素残留的方法.结合Q-TOF-MS/MS定性精确、结构信息丰富的特点,推测了部分雌激素的裂解途径.此研究能为水产品中激素类药物残留的快速鉴定提供分析手段,也有助于了解雌激素残留分布的规律,为保证食品安全提供方法借鉴.

参考文献:

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作者:卢巧梅 单位:福州大学食品安全与检测重点实验室

分析测试技术与仪器杂志责任编辑:冯紫嫣    阅读:人次
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