多糖的药代动力学研究范文

1生物样品中多糖的分析检测方法

1.1放射性同位素标记法多糖经放射性同位素标记后,在生物样品中产生的放射性强弱可间接表征其浓度高低,并通过X线胶片或储存磷光屏感光可反映多糖在体内的分布情况,操作简便且检测迅速。常用的放射性同位素有125I、124I、14C、3H、2H和99Tcm等。经3H标记的甘露聚糖通过灌胃或腹腔注射给药后,可采用液体闪烁记数仪测定其在小鼠血液、组织、尿液和粪便中含量变化,结合实验动物整体切片放射性自显影可测定多糖在各脏器的分布。2H标记的壳聚糖棒经手术植入大鼠胫骨中,通过局部组织的放射性动态变化可测算壳多糖的吸收情况。此外,放射性标记法还用于分析测定链球菌肽聚糖经腹腔注射后在大鼠体内的降解和保留,以及透明质烷在大鼠和狗体内的吸收、分布和排泄。特别地,Lendvai等采用同位素标记法探讨了新型隐球菌多糖在小鼠体内分布的相关免疫机制。然而,同位素标记法分析多糖的量变及分布时,各组织的总放射性并不完全等同于组织中实际的多糖含量,还应考虑机体内降解作用对测定真实性的影响,可结合其他方法识别降解产物及其放射性加以矫正。

1.2分光光度法分光光度法测定多糖常采用的显色剂有活性艳红3B-A、天青A和1,9-二甲基亚甲蓝。活性艳红3B-A与氨基多糖的反应络合物在波长575nm处有特征吸收,可实现比色定量,在5～80μg•mL1浓度内线性关系良好。探针天青A可以通过静电作用与大鼠血浆中茯苓硫酸酯化多糖结合,在相邻分子蒽状杂环之间发生共轭偶合,定向聚集产生变色效应,且620nm处吸收度在1～10μg•mL1浓度内呈现负线性相关。相似的,基于硫化多糖与1,9-二甲基亚甲蓝结合的比色法也能有效测定多糖在大鼠血液和尿液中的浓度,但该染色法并不适合正常哺乳动物尿液中葡萄糖胺聚糖的定量检测,因为尿液中的其他低分子量成分会干扰染色使测定结果偏高。

1.3荧光光度法Polymer-H是荧光标记的合成聚合物,能特异结合硫化多糖,且荧光强度与多糖浓度(0.63～5.0μg•mL1)存在显著的剂量依赖关系。在葡聚糖的还原性末端共价结合二氨基丙烷(DAP),再将分子探针AlexaFluor488结合到DAP上生成荧光标记产物,可测定在大鼠体内的多糖。此外,FITC标记壳聚糖的荧光强度在0.125～4.00μg•mL1线性良好。

1.4生物测定方法经(1→3)-β-D-葡聚糖活化的凝血因子G能激活凝固酶原,使之转化为凝固酶而产生凝集反应,鲎三肽被凝固酶水解释放出对硝基苯胺(PNA)在溶液中呈黄色,再加入偶氮试剂生成玫红色产物可以比色定量,而生成的PNA量与(1→3)-β-D-葡聚糖浓度成正比。采用鲎试剂凝集反应测定比格犬和大鼠血清中香菇多糖浓度,在5～200ng•mL1内线性关系良好。此外,通过该法也能测定静脉注射后兔血清中白色念珠菌(1→3)-β-D-葡聚糖的含量的量效关系(r=0.985),由此可通过NO释放间接测算样品中多糖浓度。

1.5其他方法陈地灵等采用苯酚硫酸法测定巴戟多糖经大鼠在体小肠灌注吸收后的浓度变化,并利用酚红在小肠内基本不吸收的原理,通过酚红浓度变化对灌流液体积进行校正,消除体积变化对多糖浓度的影响。将茶多糖和当归多糖制备为多糖铁复合物,可通过比色法或原子吸收法测定铁的含量来反映多糖浓度,但结果易受复合物解离的影响波动较大。

2多糖的药代动力学研究概况

2.1血药浓度活性多糖给药后的血药浓度时间曲线大多数符合二室模型,如静脉注射于大鼠的麦冬多糖;灌胃于大鼠和静脉注射于家兔的硫酸多糖916;静脉注射于比格犬、小鼠和大鼠的香菇多糖及其脂质体。白芨多糖静脉注射后在兔体内的动力学符合三室模型,按一级速率过程消除,呈线性特征。而在灌胃剂量25～100mg•kg1内,贻贝多糖MA在大鼠体内呈非线性特征。

2.2吸收和分布多糖经肠道上皮吸收的途径包括细胞旁路和跨细胞膜,而研究方法主要分为3类。①在体法。如在体全小肠段灌注实验发现,巴戟多糖的小肠吸收符合Fick’s扩散定律,为被动扩散;六味地黄多糖经在体肠灌流后在十二指肠/空肠上段、空肠下段和回肠的吸收率分别为16.5%、6.32%和3.09%,而在大肠中不吸收,其吸收方式可能主要为胞饮作用。②离体法。大鼠外翻肠囊模型证实黄芪多糖在整个小肠段均有吸收,且主要以未解离状态通过小肠细胞的胞饮作用摄取;离体组织分析发现,经口灌胃的FITC-氨基多糖微粒先后分布于大鼠胃部和小肠各段,且8h后主要集中在小肠末端。③细胞模型法。Caco-2细胞模型能模拟人小肠的生理状态,应用于肉苁蓉多糖的吸收转运研究发现,多糖在1.87～40.00mg•L1内的Papp(A-B)均小于1×107cm•s1,属于吸收不良药物;贾晓燕研究证实,氨基多糖主要黏附于Caco-2细胞膜边缘和细胞间隙,而经纳米化之后跨细胞膜进行转运的能力显著增强。多糖在组织器官中的分布可能主要存在两种作用,即“主动”靶向和“被动”靶向。其“主动”靶向的实质为组织细胞摄取,主要方式为吞噬和胞饮,且肝脏和脾脏是首要的靶向器官。阿拉伯半乳聚糖和芽霉菌糖可能通过唾液酸糖蛋白受体介导的胞吞作用主要分布于肝实质细胞中,而实质细胞对125I-葡聚糖的摄取为胞饮作用。葡聚糖在肝脏和脾脏中的分配容积由单核巨噬细胞、肝脏血小板以及脾脏和肾脏对多糖的摄取所决定。银耳多糖经静脉注射后主要通过大鼠肝脏Kupffer细胞吞噬摄取。除肝实质细胞和Kupffer细胞外,肺和脾脏中的吞噬细胞,以及肝脏上皮细胞,也能特异性摄取多糖。然而,多糖被摄取前首先要经血管转移到组织,因受毛细血管内皮的阻碍可能选择性分布在毛细血管有孔或不连续的组织中,如肝脏、脾脏、骨髓和肾脏,存在靶向被动性。肝脏不连续内皮毛细血管的孔径约100nm,且孔率达6%～8%,部分多糖不用与实质细胞表面结合就能进入血液循环。

2.3降解和排泄多糖进入机体后,在内源性酶或微生物(酶)的作用下可能发生一定程度降解。小鼠结肠中含有大量分解葡聚糖的厌氧菌,相对分子质量44kDa的葡聚糖经灌胃12h后,以完全解聚或降解的形式由粪便排出。且体外实验证实,该葡聚糖在脾脏、肠道、肝脏和肾脏匀浆中少量葡聚糖分解酶的作用下发生降解。壳聚糖及其高分子降解产物不易经外周组织吸收,主要由尿液排出体外。而低分子量壳聚糖及其部分降解产物主要经血管转移到外周组织如肝脏,并进一步降解为小分子。相对分子质量约460kDa的FITC-羧甲基壳聚糖经腹腔注射24h后,在大鼠肝脏中降解至相对分子质量10kDa以下。此外,来源于A群和D群链球菌细胞壁的肽聚糖多糖(PG-PS)经腹腔注射后,均在大鼠血液和关节中发生显著降解(相比肝脏和脾脏)。甘露葡聚糖经灌胃和腹腔注射给药后,主要通过粪便和尿液排出,其中粪便中含22%原形糖,而尿液中未检出原形糖。FITC-氨基多糖(AP)腹腔注射到小鼠体内24h后,绝大部分通过肾脏和尿液排出。同样,相对分子质量4.8kDa的麦冬多糖经静脉注射后由大鼠肾脏快速排除,且肾脏中的多糖蓄积量显著高于其他组织。伤寒沙门菌多糖经静脉注射后,在兔血液中的清除速率呈双相曲线,可能与多糖的不均一性有关,其中快速清除相为肾脏排除的具有特异抗原特性的组分。

3影响多糖药代动力学的因素

3.1理化性质多糖的理化性质,包括相对分子质量、电荷和化学构象等,是影响其PK的重要因素。一般而言,小分子多糖通过被动扩散或载体转运吸收;脂多糖通过膜脂扩散或淋巴系统吸收;水溶性多糖通过水合孔和(或)细胞间隙扩散,经内吞或胞饮作用进入细胞。多糖进入血液循环后,其消除半衰期及组织器官蓄积量均会随相对分子质量的增大而增加,并根据其结构特征和电荷性质表现出不同的靶向性。此外,肾小球(<10nm)对多糖的过滤作用不仅与其相对分子质量和电荷性质有关,还受其分子形态和刚性影响。3.1.1相对分子质量临床调查发现,作为抗癌药物前体的多糖,其相对分子质量大多介于25～50kDa,除了多糖自身的抗癌活性因素外,还与PK有关。当氨基多糖的相对分子质量从213kDa降至10kDa时,A549细胞对其摄取率也减少了26%。相对分子质量大的多糖通常表现出较低的清除率和较长的血浆保留时间。随着相对分子质量的增大(39、73、90kDa),白芨多糖在兔体内的t1/2β、MRT0t[n]和MRT0∞均随之增大。相对分子质量显著影响外周组织对腹腔注射壳聚糖的摄取,112.3kDa壳聚糖的分布为肾脏>脾脏>肝脏,而496.2kDa壳聚糖的分布为脾脏>肾脏>肝脏。对于经口灌胃的壳聚糖,其相对分子质量(0.99、39.1、760kDa)越大,则相同时间的血药浓度越低。麦冬多糖ROP经20～40kDa的聚乙二醇修饰后尾静脉注射,在大鼠血液中的消除半衰期(0.7h)增加了47～126倍,但经2和5kDa聚乙二醇修饰后的消除半衰期无显著增加。不同结构多糖表现出的PK-相对分子质量关系存在明显的差异:相对分子质量并不影响肝细胞对阿拉伯半乳聚糖的结合摄取;肝细胞对阳离子葡聚糖丝裂霉素C结合物的摄取能力随相对分子质量的增加而增强;大鼠和小鼠肝细胞对荧光标记葡聚糖的摄取清除随相对分子质量的增加而减少。向大鼠静脉注射不同相对分子质量和分子结构的硫化多糖,发现肾脏对这些大分子的选择渗透性与其分子尺寸相关,但不同结构多糖实现肾脏排除的极限相对分子质量有所不同,对于硫化葡聚糖大约为8kDa,而硫化软骨素为30kDa。

3.1.2电荷性质肝细胞表面带负电荷,对阳离子多糖的摄取率较阴离子多糖高。带正电荷的氨基多糖纳米微粒经荷瘤小鼠口服吸收后在肝脏中的分布量最高,其次是肾脏以及瘤组织。同样,肿瘤细胞表面的负电荷性较正常细胞强,更易吸附摄取正电荷多糖。氨基多糖对肿瘤细胞较高的亲和能力在一定程度上取决于影响电势的脱乙酰度。但Takakura等的论点截然相反,认为阳性多糖静脉注射后在肿瘤小鼠体内经肝脏和肾小球快速消除,而阴性多糖在体内保留时间较长,表现出较高的肿瘤放射性蓄积。对于抗肿瘤活性多糖,其肿瘤组织分布量和肿瘤细胞摄取能力之间可能存在一定矛盾。

3.1.3脂质化和纳米化脂质化能有效改变香菇多糖在比格犬和大鼠体内的PK特征,显著增加血清中多糖的t1/2α、t1/2β和MRT。经尾静脉注射给药后,香菇多糖在小鼠体内的靶向效率顺序为脾>肝>心>肾>肺,而香菇多糖脂质体为脾>肝>肺>心>肾。经腹腔注射给药后,香菇多糖在大鼠体内的靶向效率顺序为脾>肝>肾>肺>心,而香菇多糖脂质体为脾>肝>肺>肾>心。氨基多糖主要黏附于Caco-2细胞表面,通过细胞间隙途径进行吸收转运,而纳米化后能够跨膜进入细胞内部,且该途径为协助扩散,不受温度影响,由此说明纳米化有利于提高氨基多糖跨肠上皮细胞转运的能力。

3.2给药方式

3.2.1灌胃和注射给药的比较Caco-2细胞模型的Papp值显示肉苁蓉多糖属吸收不良药物,多糖经灌胃给药后对小鼠吞噬功能和免疫器官指数无显著影响,而腹腔注射给药的效果明显。同样,银耳多糖灌胃给药后,仅有微量进入大鼠血液,绝大部分通过胃肠排出体外。而经静脉注射后,银耳多糖在血液中清除速度很低,主要分布于肝脏、肾脏和肠道中,并最终由肾脏排除。六味地黄多糖CA4-3经静脉注射和灌胃后的血药浓度变化明显不同,灌胃给药的吸收率仅为静脉注射的35.9%。相对分子质量5kDa的麦冬多糖FOJ-5经静脉注射后,在大鼠血浆中的消除半衰期(15mg•kg1,18.1min)要比灌胃给药的半衰期短(50mg•kg1,28.9min)。

3.2.2不同注射方式的比较茯苓多糖硫酸酯(PS)经腹腔注射后在大鼠体内的消除半衰期、血浆清除率、表观分布容积和AUC等均高于尾静脉注射,两种方式的PS消除均符合一房室、一级消除的开放模型。而麦冬多糖聚乙二醇修饰物经静脉注射和皮下注射给药后,在大鼠体内的消除行为基本相同,给药剂量与AUC呈良好的线性关系,但后者在体内平均滞留时间较前者增加了2.4倍。此外,来航鸡经腹腔注射药用真菌8301多糖的吸收速率要显著高于胸肌注射。

3.3给药剂量静脉注射和皮下注射的麦冬多糖聚乙二醇修饰物在大鼠体内的AUC0∞和CL随剂量(9～50mg•mL1)的增加而增大,但消除半衰期t1/2、表观分布容积Vd和MRT0∞与剂量无线性相关。随着灌胃剂量的增加,贻贝多糖MA在大鼠体内的消除半衰期t1/2和MRT减小,Cmax、tmax、AUC0∞和CL增大,剂量与Vd值无明显线性关系。香菇多糖脂质体在比格犬血清中的t1/2α、t1/2β、MRT、AUC和Cmax随静脉注射剂量的增加而增加,剂量与Vd、CL和tmax值无明显线性关系。由此可见,不同多糖的PK量效关系存在差异。小鼠肝脏对相对分子质量40kDa的葡聚糖的摄取表现出一定的剂量依赖性,剂量越大,肝脏摄取量越小。葡聚糖在糖尿病小鼠肝脏中蓄积的显著降低与其高血糖作用有关,高渗介质能抑制大分子的细胞内吞作用。此外,肝脏对阿拉伯半乳聚糖的摄取也具有明显的剂量依赖性,但剂量并不影响肾脏对其摄取。

4小结与展望

多糖既是特异的功能因子,又是重要的功能载体,受到生物医药和功能食品领域学者的高度关注,并展示出广阔的应用前景。当前,多糖的提取纯化及功效评价已相对成熟,且在结构解析、构效关系及作用通路等分子机制等方面也取得了大量研究成果。然而其PK研究却显得十分薄弱,相比其他功能小分子,主要的挑战在于:①多糖结构的特殊性导致其定量检测难度大,且灵敏度往往难以满足生物样品分析;②多糖在体内的代谢清除过程十分复杂,即使有足够灵敏的检测方法,也无法确定结果的真实性,还需进行定性分析;③多糖不可能如小分子物质那样纯化可得到单一成分,均一多糖也只是相对分子质量相对集中的一类多糖混合物,可能存在不同的电荷性质、糖苷键链接和分子构象等,并表现出不同的PK特征;④多糖的PK不仅与自身的理化性质、给药方式及剂量密切相关,还可能受其他物质如肠道吸收促进剂的影响。多糖的PK是一项复杂的系统研究,而后期的研究重点可能将主要集中在两个方面。首先,研究建立生物样品中原形多糖的定量和定性检测方法,该方法应具有较高的灵敏度和较低的检出限。其次,结合多糖的改性技术,深入探究其理化特征与PK和生物功效之间的关联性,为指导多糖的分子修饰及应用方案制定奠定理论基础。

作者：易阳王宏勋何静仁单位：武汉轻工大学食品科学与工程学院