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图书馆室内空间布局

[摘要]目的摘要:在外源抗原表位表达载体系统中构建并表达乙型肝炎病毒(HBV)抗原表位,并对其诊断敏感性进行评价。方法摘要:人工合成编码HBV“a”抗原决定簇表位中24个氨基酸(S124147)的寡核苷酸序列,克隆入外源抗原表位表达载体系统FHVRNA2I3位点,构建重组质粒,在原核pET系统(BL21细胞)中表达。通过ELISA和Westernblot检测表达产物的抗原性,并以表达产物为包被抗原,通过ELISA和Westernblot检测58份乙肝患者血清抗HBs。结果摘要:嵌和蛋白可和抗HBs特异性结合,其ELISA检测抗HBs阳性率为77.5%,Westernblot的为68%,而对照试剂盒的为62%。结论摘要:在外源抗原表位表达系统中表达的HBV重组抗原表位具有良好的抗原性,有诊断应用价值。

[]HBV;抗原表位;抗原性;FHVRNA2载体系统

乙型肝炎病毒(HBV)是乙型肝炎的病原体,并引起慢性肝炎和肝硬化,而且和肝癌的发生密切相关。迄今,对HBV感染最有力的预防和控制办法,仍是发展疫苗。FHVRNA2载体系统[1]是一个以昆虫小RNA病毒flockhousevirus外壳蛋白为载体的新型抗原表位表达载体,此系统中表达的载体蛋白可自动组装成病毒样颗粒,使插入的外源抗原表位可以暴露在颗粒的表面,保持天然构象和免疫学特性。本探究拟将HBVa抗原表位插入到FHV外壳蛋白上,并对其抗原性及诊断意义进行了探究。

1材料和方法

1.1细胞重组质粒DNA大肠杆菌DH5α用于重组质粒pETEDNA的克隆和扩增。大肠杆菌BL21(DE3)用于重组质粒pETEDNA的表达。质粒DNA在含200μg/ml氨苄青霉素的LB或TB培育中生长,FHVRNA2载体系统即重组pETFHV构建见[1]。

1.2HBV抗原表位及重组pETE的构建和表达

1.2.1HBV抗原表位及重组pETE的构建人工合成HBV特异抗原表位E(氨基酸序列摘要:124CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC147)寡核苷酸序列摘要:正向5’GATGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGC3’;反向3’CTACGTGCTGAGGACGAGTTCCGTTGAGATACAAAGGGAGTACAACGACATGTTTTGGATGCCTACCTTTAACG5’,两端为Bsu36I识别位点,和经Bsu36I功能后的重组pETFHVDNA混匀后置室温连接2h,转化DH5α细胞,接种LB平板(200μg/mlAmp)培养。重组质粒pETEDNA经酶切筛选并经DNA序列测定。

1.2.2携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达重组pET系统中,嵌和蛋白的表达受T7启动子的控制[2]。BL21经重组pETEDNA转化后,在TB培养液中37℃生长16h~18h,细胞经4000r/10min离心沉淀,用超声裂解缓冲液悬浮,超声裂解,裂解液经离心,弃上清,沉淀(包涵体)用8mol/L尿素溶解。

1.2.3SDSPAGE及Westernblot分析方法见前文[1,3],3,3二氨基苯胺四氢盐酸(DAB)底物试剂为AMRESCO公司产品;第二抗体辣根过氧化物酶(HRP)结合物购自华美公司。

1.3HBV重组抗原表位诊断意义评价

1.3.1ELISA检测血清样本固相ELISA检测如前文所述[1],以纯化的嵌和蛋白为包被抗原,每孔100μl(含1μg纯化嵌和蛋白),检测58份乙肝患者血清中抗HBs,和抗HBsELISA检测试剂检测结果比较。阳性判定标准为(检测血清A492底物对照A值)/(阴性血清A492底物对照A值)%26gt;2.1。邻苯二胺二氢盐酸(OPD)购自AMRESCO公司;第二抗体辣根过氧化物酶(HRP)结合物购自华美公司;乙肝患者血清由昆明市传染病医院收集;抗HBsELISA检测试剂盒购自上海科华公司。

1.3.2HBV重组抗原表位Westernblot检测血清样本方法见前文[3],检测了58份乙肝患者血清样本。

2结果

2.1携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达FHVRNA2cDNA载体系统即重组pETFHV构建见文献[4],其编码产物是FHV外壳蛋白,三维立体结构已得到精确测定,其上有6个可供外源抗原表位插入的位点[5](见图1)。应用该系统,我们将人工合成HBV抗原表位寡核苷酸序列插入到重组pETFHVDNA上,构建携带HBV抗原表位的重组质粒pETE,经NsiⅠ和NcoⅠ双酶切筛选(见图2)和DNA序列测定无误后转化BL21细胞,高水平表达嵌和蛋白。经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色(见图3)和Westernblot(见图4)分析结果表明,这些嵌和蛋白为携带有HBV抗原表位的重组FHV外壳蛋白。

图1FHV外壳蛋白的三维结构摘要:示可供选择的外源抗原表位序列插入位点L1、L2、L3、I1、I2,I3HBV抗原表位氨基酸序列在FHV中插入位点。(略)

图2重组质粒NcoⅠ+NsiⅠ酶切图(略)

2.2携带HBV重组抗原表位的嵌和蛋白在BL21中的表达和鉴定携带HBV抗原表位的重组质粒pETFHVE在BL21(DE3)转化细胞中高水平表达了携带HBV抗原表位的嵌合蛋白FHVE,其分子质量和阳性对照相同,约为45000(等于载体FHV外壳蛋白的分子质量43000加上HBV抗原表位的分子质量)。经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色(见图3)及Westernblot(见图4)分析结果表明,重组抗原表位显示了抗原性。

图3携带HBVa特异抗原表位的嵌合蛋白SDSPAGE(10%)分析(略)

图4嵌合蛋白的Westernblot分析(略)

2.3HBV重组抗原表位ELISA检测敏感性分析我们用嵌和蛋白为包被抗原用间接ELISA法检测58份乙肝患者血清中抗HBs抗体,检测阳性率为77.5%,高于ELISA试剂盒检测的62%。

2.4HBV重组抗原表位Westernblot以嵌和蛋白为包被抗原用Westernblot检测58份乙肝患者血清中抗HBs抗体,检出阳性率为68%。

3讨论

3.1HBVa抗原表位在疫苗及诊断应用探究中的意义根据HBsAgS蛋白的抗原性不同,将HBV分为9个血清型(即HBsAg亚型)[6,7]摘要:ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq-、adrq+。HBVS蛋白第120~第160氨基酸序列是HBV的交叉中和抗原表位即a表位[8],可诱导产生交叉中和抗体,保护成人免受各HBV亚型的感染。本探究进一步表明,HBVa重组抗原表位可和临床不同来源的血清抗HBs发生特异性结合,具有疫苗探究和诊断意义。

3.2新型抗原表位表达载体系统对于抗原表位来说,决定其免疫原性和抗原性的因素除了氨基酸序列,更重要的是分子的空间构象和呈递给免疫细胞识别的方式。利用FHVRNA2表达载体在大肠杆菌中表达的抗原表位具有良好的免疫原性,免疫小鼠产生了交叉中和抗体[9],并已成功的在该系统中表达了HIV1V3、轮状病毒Vp4抗原表位和HCV抗原表位,并诱导中和抗体和交叉中和体产生[1,10,11]。HBV抗原表位在FHVRNA2载体系统可中高效地表达,并近似天然构象,能被天然抗HBs抗体特异性识别结合,具有良好的抗原性,在以其为包被抗原用ELISA和Weternblot检测抗HBs中检测敏感性和ELISA诊断试剂盒差异无显著性,在HBV诊断试剂和重组抗原表位亚单位疫苗探究中具有重要意义。