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脑膜炎奈瑟菌的检测技术和检测进展

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关键词:流行性脑脊髓膜炎;脑膜炎奈瑟菌;实验室技术

流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)是由脑膜炎奈瑟菌(Nm)通过呼吸道传播引起的化脓性脑膜炎,为急性呼吸道传染病,常在冬春季引起发病与流行。脑膜炎发病迅速,病死率超过20%,且后遗症严重[1]。我国90%以上的患者是由A群Nm引起。Nm是只存在于人体的需氧双球菌,其外膜含脂多糖成分,致病性Nm的外膜外有荚膜多糖。Nm有多基因差异。根据Nm荚膜多糖的不同,分为12个血清群:A、B、C、H、I、K、L、X、Y、Z、29E、W135和不能分群菌株。Nm的病原学检测包括细菌培养、革兰染色、生化鉴定、血清学分群,乳胶凝集反应直接检测抗原等。脑脊液革兰染色仍是快速检测Nm的重要方法之一,患者淤点(斑)、脑脊液涂片检测时在中性粒细胞内见到革兰阴性肾形双球菌或脑脊液、血液培养Nm阳性或脑脊液、血液Nm特异性核酸片段检测阳性都可作为流脑的确诊依据。病原学检测是检验Nm的传统方法,但因Nm对冷、热、干燥和化学消毒剂的高度敏感性和对外环境的弱抵抗力,以及临床标本的采集、运送、培养、接种方式、培养基质量、检测人员的经验等都可能影响检验结果的准确性。PCR分子学诊断的优点是可测出菌群特异性NmDNA,不要求阳性结果中存在活的病原体,且结果可在2h内获得[2]。目前,高敏感性、高特异性、操作简便的分子生物学检验技术已广泛应用于Nm感染的检验诊断。本文就Nm的检测技术及检测进展作初步综述。

1Nm的病原学检测技术

病原学检测是最早应用于细菌检测的方法。分离出Nm是诊断流脑的“金标准”,其鉴定方法包括革兰染色、氧化酶试验、生化鉴定、血清学分群等。基于获得的阳性菌株,可进行进一步的研究,比如体外药物敏感试验就必须首先分离到阳性菌株。李马超等[3]就曾对其实验室2005-2006年分离的49株Nm菌株(16株A群、33株C群)进行体外抗菌药物敏感性检测,结果表明,16株A群Nm菌株对复方磺胺甲噁唑、四环素、左氧氟沙星、萘啶酸4种抗菌药物耐药,对环丙沙星耐药或中度敏感,33株C群Nm菌株对复方磺胺甲噁唑耐药,31株(93.9%)C群菌株对萘啶酸耐药,20株(60.6%)C群菌株对左氧氟沙星耐药,17株(51.5%)C群菌株对环丙沙星耐药,4株A群和1株C群Nm菌对青霉素不敏感。冯君平等[4]进一步探索了A群、C群Nm的最适培养基,结果表明添加酵母浸出粉的培养基可作为A群、C群Nm培养的最适培养基。郑春早等[5]配制了一种小牛血清“双抗”培养基作为Nm的增菌培养基,与常规检测培养基比较表明,应用小牛血清“双抗”培养基建立的新方法适用于A、B、C群Nm的检测,且检测效果明显优于常规的咽拭子直接接种法。病原学检测的缺点是比较繁琐、耗时、影响因素多,特异性可能不够好。

2Nm的普通聚合酶链反应(PCR)

PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,对于不能用血清学分群的Nm疑似菌株或无法进行Nm分离培养的脑脊液、血液、血清标本可采用PCR进行DNA扩增辅助检测鉴定。近年来PCR技术广泛应用于Nm的检测中[2,6]。黄亮等[7]采用普通PCR技术对流脑疑似病例的脑脊液和血液标本中Nm种属及各群的特异性DNA片段进行了检测,发现6例流脑疑似患者的脑脊液标本中有5份Nm属特异性基因CrgA阳性,5份检出NmC群SiaD(C)基因片段;血液标本中1份检出NmCrgA基因,1份检出NmC群SiaD(C)基因片段。张文艳等[8]对Nm血红素加氧酶的基因Hemo进行扩增,结果表明,Nm标准菌株为阳性结果,即扩增出长为424bp的DNA片段,而肺炎链球菌、乙型流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌均未扩增出该DNA片段,为阴性结果;PCR技术能检测出4pg的脑膜炎双球菌DNA,具有高敏感性;11份脑脊液样品NmPCR检测常规培养检测结果显示,PCR检出率为36.3%,而培养法的检出率为18.2%,PCR明显高于培养法(P<0.05)。徐丽等[9]则利用普通PCR技术建立了检测29E群、X群和Z群等3个血清群Nm的方法,然后将该方法应用于41份疑似Nm菌株标本的检测,结果表明,41份疑似Nm标本中,29E群和X群PCR阳性的标本分别有7份和2份,未检测出Z群菌株,建立了能准确、特异地鉴定29E群、X群和Z群Nm菌株的PCR方法。

3Nm的多重(复合)聚合酶链反应(PCR)

普通PCR主要用于单一致病因子的鉴定;多重PCR反应原理与一般PCR相同,主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定,也可用于某些遗传病及癌基因的分型鉴定。近年来,多重PCR技术越来越广泛应用于Nm的检测。任红宇等[10]针对包括Nm在内的8种细菌的特异性基因,通过优化单一PCR扩增体系及扩增程序,初步建立了能同时检测8种导致细菌性脑膜炎的病原体的复合PCR扩增方法。熊长辉等[11]应用多重PCR技术对其实验室保存的70株已经血清学鉴定的Nm进行核酸鉴定及基因分群,同时检测23例流脑疑似病例脑脊液标本中Nm特异性DNA片段,发现68株Nm的多重PCR检测结果与血清学分群结果一致,2株血清学未能分群的Nm经多重PCR检测为C群;23例流脑疑似病例脑脊液标本经多重PCR检测有5例为C群,1例为A群,1例为B群,阳性检出率为30.43%,传统的病原分离培养、生化鉴定和血清学鉴定4例为C群,阳性检出率为17.39%。可见多重PCR技术对Nm检测的特异性优于病原学检测。DIAWARA等[12]应用复合荧光实时PCR(RT-PCR)技术对脑脊液中的Nm和肺炎链球菌进行了检测,结果表明,Nm和肺炎链球菌的不同熔融温度的两峰分别为87.5℃、85.5℃。Nm和肺炎链球菌的RT-PCR的灵敏度分别为100%(95%CI:82.4~100.0,85.1~100.0),二者特异度相同,均为100%(95%CI:88.6~100.0)。Nm和肺炎链球菌引起的脑膜炎的诊断准确率分别提高到50.7%和28.6%。DEFILIPPIS等[13]利用多重PCR技术对Nm、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌进行了检测,总共收集了110个分离株和134例临床标本(99例脑脊液和35例血液标本)并进行了分析,结果表明,所使用的方法快速、特异性好、灵敏度高。ZHU等[14]利用多重PCR技术对Nm进行了基因分型。结果表明,其检测灵敏度为1ng基因组DNA(相当于4×105基因组),脑脊液标本中为3×105cfu/mL,这种多重PCR检测可能有助于临床诊断和流脑流行病学监测。

4荧光定量PCR检测Nm法

荧光定量PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性探针对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,通过相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始水平。雷永良等[15]应用该技术对167例流脑监测标本进行了检测,并与传统的病原学检测进行比较,结果表明新方法与传统方法阳性符合率为55.56%,另有4例传统方法检测为阴性的标本用荧光定量PCR检测为阳性,其特异度、灵敏度都高于传统培养法,且检测周期更短。杨艳等[16]针对Nm特异性基因porA设计引物、探针,用实时荧光PCR技术进行检测,并与常规PCR比较,结果表明应用实时荧光PCR检测时,64株Nm检测结果均为阳性,6株非Nm结果均为阴性。检测灵敏度达5.0×103cfu/mL,即5cfu/test,比常规PCR灵敏度高10倍,并且结果重复性好。张晓春等[17]采用荧光定量PCR检测健康者咽拭子中Nm的带菌情况,结果表明,荧光定量PCR的灵敏度、特异度均为100%,阳性预测值(PPV)为13.09%,阴性预测值(NPV)为100.00%,检出限为0.5cfu/50μL体系,荧光定量PCR检出结果的时间为3h,而培养法至少要2d。该方法可用于疾病的快速诊断,特别适合健康者的带菌率调查。MIRONOV等[18]采用荧光定量PCR技术对Nm参考菌株和187例脑膜炎患者的脑脊液进行研究,结果表明该方法比传统培养法有更好的特异性和敏感性。文献[12]也将荧光定量PCR技术与多重PCR技术结合,取得了良好的实验结果。

5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Nm抗体水平

应用ELISA间接法检测患者急性期和恢复期血清中的抗体水平,如恢复期效价较急性期呈4倍或4倍以上升高,可作为流脑的辅助鉴别。ELISA间接法也可以应用于健康者血清抗体的测定,结果可为当地的流脑防控提供参考。张洪飞等[19]应用ELISA分析了通辽市科左中旗221例健康者Nm带菌情况及其抗体水平,检出脑膜炎双球菌13株,总带菌率为3.81%;A群抗体阳性率为71.91%,C群抗体阳性率为47.51%,为该地区今后的流脑预防、控制提供了科学依据。

6Nm的分子分型及其他新技术

多位点序列分型(MLST)技术是从基因水平通过管家基因的点突变对Nm进行分型,利用MLST可以对数十年前不同地区分离的菌株之间的亲缘关系进行评估,尤其是对不同菌群之间基因发生的频繁的重组事件,分析菌株进化关系及判断分离株是否属高致病性克隆系等方面,可弥补传统血清型分型方法的不足[20]。MLST适合用于长期的、大范围的流行病学调查和监测菌群结构变化,研究地域性传播和流行性变迁。两株细菌MLST分型结果相同,表示这两株细菌属于相同的克隆或者克隆群,不能认为他们之间有流行病学联系。朱水荣等[20]采用MLST技术,对浙江省2004-2013年部分Nm菌株开展基因分型研究,得出了浙江省Nm分离株间的遗传进化关系,为今后有针对性地制订流脑预防控制措施提供参考。邓小玲等[21]则采用MLST技术,对广东省Nm分离株间的遗传进化关系进行了研究,为有针对性地采取预防控制措施提供依据。脉冲场凝胶电泳(PFGE)是一种分离大分子DNA的方法,实践表明,大于40kb的DNA不能在恒强水平琼脂糖凝胶电泳中分离,PFGE解决了这一难题。PFGE可以用来分离相对分子质量10kb到10Mb的DNA分子。其分型的基础是大片段的插入、缺失、重组或质粒的获得、丢失或酶切位点的点突变。MOODLEY等[22]应用PFGE技术对南非2002-2006年B群Nm克隆分析,发现了一个新的基因克隆ST-4240/6688。邵祝军等[23]则应用PFGE技术对中国C群Nm分离株进行分析,结果发现AH1是中国C群Nm主要的带型。在流脑调查中,上述两种分子分型的运用原则:暴发调查时所有菌株进行PFGE,挑选代表菌株进行MLST,对于流脑特异性引物PCR扩增阳性的患者血清或者脑脊液未能分离到菌株的进行MLST;个案调查时所有菌株进行PFGE和MLST分型,对于流脑特异性引物PCR扩增阳性的患者血清或者脑脊液未能分离到菌株的进行MLST;健康携带情况调查及在全国范围的、长期的流行情况调查时所有菌株进行PFGE,挑选代表菌株进行MLST分型。多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)也是一种分子分型技术,其分型依据为VNTR位点的滑链突变。该方法具有较好的分辨力、重复性、分型力及可比性,操作简单,试验周期为1d。SHAN等[24]应用MLVA技术分析了序列型为ST-4821的C群Nm引起的2010年中国山东省的流脑疫情暴发。2000年日本学者发明了恒温核酸扩增技术,即环介导等温扩增技术(LAMP)。

近年来该技术已成功地应用于流脑、SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中。LEE等[25]应用LAMP技术对脑脊液中的Nm进行了快速鉴定,结果表明,该方法灵敏度高(比传统的PCR方法高2~5个数量级),反应时间短(30~60min就能完成反应)。蛋白质组学技术是从蛋白质水平进行生命科学研究的新方法。有疾控工作者用该方法初步探索了Nm部分蛋白表型特征分析。胡源等[26]利用双向电泳技术与质谱结合的蛋白质组学技术对66株C群Nm菌株及2株参考菌株的部分外膜蛋白和sucD蛋白表型进行分析,根据外膜蛋白和sucD蛋白将实验菌株共分为9型,其中安徽菌株分型结果显示出了高度的一致性,而其他地区菌株分型分布则显示出高度的多态性,结果对认识安徽省流脑的流行规律和有效进行流脑疫情的防控具有重要意义。综上所述,Nm的实验室检测技术涉及传统的病原学检测技术、免疫学ELISA及不断更新的分子生物学方法,如PCR、荧光定量PCR、多重PCR、LAMP技术、MLVA分型、MLST技术、PFGE分型、蛋白质组学技术等。Nm的分子生物学方法比传统病原学检测法具有更高的特异性和灵敏度。当然各种技术并非单一的,实际工作中可能相互融合,以更好地优化Nm的检测分析。新的方法也有其不足之处,如LAMP因灵敏度高,容易形成气溶胶污染,由于国内大多数实验室不能严格分区,假阳性问题可能比较严重,因此,引物设计要求比较高,有些疾病的基因可能不适合使用LAMP;蛋白质组学技术中2-DE技术还不成熟,现在有更新的色谱质谱联用法取代2-DE和质谱鉴定法,对蛋白质的鉴定更准确,将更好地服务于疾病预防控制工作中。

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作者:廖春艳综述;李志峰;段刚;审校 单位:重庆市疾病预防控制中心

脑膜炎奈瑟菌的检测技术和检测进展责任编辑:张雨    阅读:人次