1材料与方法
1.1材料姜黄素（Curcumin,CUR），罗丹明－123（Rhodamine-123，R-123）及MTT均为Sigma公司产品。盐酸阿霉素（Adriamycin，ADR）为深圳万乐药业公司产品。DMEM培养基为Gibco公司产品。膀胱移行细胞癌株BIU-87，由北京医科大学泌尿外科研究所馈赠；耐药株BIU-87/ADR系由本实验室通过采用递增阿霉素剂量的方式诱导建立的呈典型MDR表型的耐药细胞亚株。高表达P-gp。细胞在含0.5mg·L-1浓度的阿霉素、10%胎牛血清的DMEM培养基中以37℃，5%CO2条件培养，实验前2d换无药培养基培养。
1.2方法
1.2.1MTT实验将处于对数生长期的两种细胞分别以2×104/ml浓度接种于96孔培养板，每孔终体积200μl。上述条件下培养24h，小心吸尽每孔培养液。实验组Ⅰ分别加入不同浓度的阿霉素、实验组Ⅱ分别加入不同浓度的阿霉素加姜黄素（以终浓度0.1%DMSO助溶）。阿霉素终浓度分别为0.05，0.1，0.25，1.5，5(μg/ml)，姜黄素终浓度为25μmol·L-1。对照组Ⅰ为不加细胞仅含培养液的空白对照，对照组Ⅱ为不加药物仅加细胞的阴性对照，以上述条件培养48h后，每孔加MTT(5mg/ml)液20μl，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加150μlDMSO，振荡10min使结晶物充分溶解。由空白孔调零后，以酶标仪检测490nm处的光吸收值(A)。
细胞存活率(IC)=实验组平均A值/阴性对照组平均A值
逆转指数(RI)=IC50(BIU-87/ADR+ADR)/IC50(BIU-87/ADR+ADR+CUR)
1.2.2罗丹明外排实验罗丹明作为P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的转运底物能较好的代表其转运功能［1,2］。将处于指数生长期的BIU-87/ADR细胞以2×104/ml接种于24孔培养板，每孔终体积1ml。上述条件下培养24h。小心吸弃培养液，加入罗丹明至终浓度为5μg·ml-1，上述条件继续培养30min，吸弃培养液，加入不含罗丹明的培养液。实验组Ⅰ仅含培养液和细胞，实验组Ⅱ在Ⅰ的基础上加入姜黄素至终浓度为25μmol·l-1，对照组为含细胞不加药液组。分别于0，0.5，1.0，2.0h收获细胞。细胞收获方法为：吸弃培养液、0.25%胰酶消化、冷PBS(0℃)吹洗、离心(800r/min)3次后，500μl冷PBS吹散细胞，在流式细胞仪上检测(激发波长480nm，发射波长540～660nm)，以荧光强度平均值（Mean）表示细胞内罗丹明浓度。细胞内罗丹明浓度以下式计算：A=实验组平均荧光强度值-对照组平均荧光强度值。
1.2.3统计学处理实验结果取3次实验的均值，标准差均小于5%，组间显著性差异用t检验。
2结果
2.1MTT试验预试验以姜黄素最高浓度25μmol·L-1作用两细胞株48h，细胞存活率均在95%以上，排除了对细胞的毒性作用（见表1）。结果表明，姜黄素略增加阿霉素对BIU-87的细胞毒性作用(P＞0.05)；而对于BIU-87/ADR，姜黄素明显增加阿霉素细胞毒性(P＜0.05)，逆转指数为4.0。
表1细胞毒分析IC50（略）
*P＞0.05，**P＜0.01
2.2细胞内罗丹明浓度图1为不同时间段细胞内罗丹明浓度的流式细胞仪检测结果。可以看出，在每一时间点，姜黄素组R-123浓度均显著高于无姜黄素组。姜黄素明显抑制了细胞内R-123的外排(P<0.05)。
图1R-123外排实验（略）
3讨论
尽管生物技术飞速发展，传统医学在世界的许多地方仍发挥着极其重要的作用。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚类色素。姜黄素及其类似物和挥发油是姜黄主要活性成分，具有抗炎、抗菌、保肝、治疗创伤、抗癌、抗病毒等活性。其抗肿瘤作用及机制正受到日益重视。
有文献表明，姜黄素对人类恶性肿瘤细胞有诱导分化和增殖抑制作用［3，4］，近年研究表明，姜黄素可促进肿瘤细胞凋亡［5，6］，并且与阿霉素、丝裂霉素具有协同作用［7～9］；有人认为其具有化疗增敏作用［10］。本实验结果显示，姜黄素可以有效逆转膀胱肿瘤的MDR，姜黄素组BIU-87/ADR对阿霉素的敏感性是无姜黄素组的4倍。P-gp具有ATP依赖的生物膜泵功能，能将胞内药物泵至胞外而产生MDR，R-123外排实验结果提示，姜黄素直接抑制P-gp的外泵功能为其机制之一。诸多研究显示，P-gp既可以单独介导，亦可以参与介导膀胱肿瘤的MDR，是膀胱癌产生MDR的重要机制。由于膀胱癌是人类常见恶性肿瘤之一，具有易复发和产生MDR的特性，因此寻找其逆转剂具有重要意义。维拉帕米、环孢素A等逆转膀胱肿瘤的MDR已有多篇报道［11］，但未见关于植物药的研究，我们的实验无疑为逆转膀胱癌MDR提供了一种新的方法。前述研究表明姜黄素发挥抑瘤效应需要较高浓度，系统用药难以保持持续高浓度，膀胱癌术后，膀胱灌注化疗是重要的治疗手段，由于系局部用药，因而具有较大的可行性。