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分子科学论文:肿瘤的分子科学研究趋向

2013/01/22 阅读:

作者:李宏单位:重庆工商大学环境与生物工程学院

DNA和组蛋白的甲基化修饰

DNA甲基化同众多疾病的发生与发展密切相关,特别是癌症,其发生过程中癌细胞基因组整体的欠甲基化和局部区域的超甲基化是其典型特征。超甲基化体现在抑癌基因的启动子区被异常甲基化,整体的欠甲基化同重复序列(如转座子)以及癌基因的启动子区的甲基化程度减小、基因组遗传不稳定性的增加密切相关。研究特定癌症中超甲基化基因的工作较多,包括乳腺癌、结肠癌、髓细胞性白血病、肝癌和卵巢癌等。随着高通量分析手段如ChIP-on-chip和ChIP-seq最近的发展,现在研究者真正能够在基因组尺度分析基因组-表观组相互作用及其对基因表达的影响。一些用于表观组分析的生物信息学软件也已经开发出来,如EpiGRAPH和Galaxy,两者结合起来可以证实富含SNP的启动子的表观遗传学修饰。当然还有一些较大规模的DNA甲基化相关数据库:如MethDB、MethyCancer、PubMeth和MethCancerDB。

MethDB和MethyCancer还提供了DNA甲基化的可视化工具。DNA甲基化是肿瘤的形成过程中可逆的表观遗传修饰,其过程是由DNA甲基化转移酶(DNMT)来完成的。DNA甲基化转移酶已成为目前DNA去甲基化恢复抑癌基因功能的热点靶分子,通过DN-MT抑制剂,可以使肿瘤中许多超甲基化的基因被重新激活。如DNMT抑制剂5-氮胞苷(5-azacyti-dine),能够参与DNA的合成,通过阻断DNMT在甲基化反应中的中间步骤,导致细胞的DNMT被迅速清除同时造成基因组DNA的去甲基。5-氮胞苷的脱氧核糖类似物,如5-aza-2'-deoxycytidine(decitabine)、Fazarabine、zebularine等也具有DNMT抑制剂的作用。

Xu等分析了启动子甲基化对BRCA1转录的影响,用5-aza-CdR和TSA瞬间处理UACC3199细胞系后,检测到了BRCA1mRNA和BRCA1蛋白的重新表达。而用zebularine处理该细胞系,则不能诱导BRCA1的重新表达。CpG位点的甲基化可降低BRCA1启动子对转录因子的易感性,这是严重甲基化的癌细胞中BRCA1下调机制之一。异染色质蛋白1(HP1)是一种强转录抑制因子,位于浓缩的沉默染色质区。HP1蛋白结合到染色质上一定程度是由特异性识别第9位赖氨酸(K9)被甲基化的H3组蛋白尾端的保守染色质结构域所介导的。这种结合是不稳定的,在有丝分裂过程中,可以被H3的第10位丝氨酸(S10)磷酸化伴随第14位赖氨酸(K14)乙酰化所逆转。这些组蛋白修饰也可根据几种受MAP激酶和NFkappa-B通路调节的诱导型启动子的活性观察到。这些修饰也可通过核受体对转录活性起作用。

组蛋白的乙酰化修饰

因核小体组蛋白乙酰化和去乙酰化影响染色质的结构及形态变化并直接参与基因表达的调节,且该修饰是可逆的,这为研究肿瘤的药物治疗提供了平台。目前与组蛋白异常去乙酰化修饰调节相关的抗肿瘤药物研发集中在HDACs抑制剂上。这类调节组蛋白异常去乙酰化的HDACs抑制剂在体外实验中能选择性的阻滞细胞周期、促进细胞分化、诱导细胞调亡、抑制血管生成等,同时对正常的细胞表现出相对较小的毒副作用,但这种选择性的作用机制目前尚不清楚。目前已经确认的HDACs抑制剂分为两类:天然化合物及其衍生物、从化合物库中筛选得到的药物。

天然化合物及其衍生物包含有:TrichostatinA(TSA)、Depudecin、CHAP31、TrapoxinA、TrapoxinB、Apicidin、Butyrates、Valproicacids、Pyroxamide等,其中Butyrates,Valproicacids属于短链脂肪酸类,Tri-chostatinA、Pyroxamide等属于异羟肟酸类,Depude-cin、Apicidin、TrapoxinA、TrapoxinB等属于环状四肽类。从化合物库中筛选得到的药物主要有SAHA及MS-275,SAHA属于异羟肟酸类,MS-275属于苯甲酰胺类。有研究报道,HDACs抑制剂TSA与DNMT抑制剂decitabine能协同逆转某些高甲基化的肿瘤抑制基因,使其重新表达;DNMT抑制剂能增强HDACs抑制剂所诱导的对肿瘤细胞的促凋亡作用。

染色体重塑

染色质重塑是基因表达调控过程中一个非常重要的环节。染色质重塑主要包括2种类型:一种是依赖ATP的物理修饰,另一种是依赖共价结合反应的化学修饰。依赖ATP的物理修饰主要是利用ATP水解释放的能量,使DNA超螺旋旋矩和旋相发生变化,使转录因子更易接近并结合核小体DNA,从而调控基因的转录过程。依赖ATP的染色质重塑活性导致超螺旋扭转,引起核小体重塑。依赖ATP的染色质重塑复合体都含有一个具有DNA激活的ATP酶活性部位,即ATP酶亚基,其核心功能是水解ATP并利用ATP水解释放的能量去减弱核小体中DNA-组蛋白的结合力。

由于核小体发生了上述重塑,使得各种染色质重塑ATP酶聚集到特异DNA位点如启动子上,与DNA结合蛋白如转录因子发生直接相互作用,激活基因转录过程。此外,在核心组蛋白氨基末端,组蛋白乙酰化通常和基因表达活化有关,而组蛋白脱乙酰化,在基因抑制中发挥作用。越来越多的研究表明,依赖ATP的染色质重塑复合体和肿瘤的形成发展有关,因此,对染色质重塑复合体及其作用机制的研究对揭示基因转录的调控、基因表达的抑制、DNA重组、复制和损伤修复以及肿瘤等一些疾病的发生发展有极为重要的意义。

生物芯片技术在肿瘤研究中的应用

高通量、基因组尺度的表达谱技术的发展可使研究者对肿瘤基因组的全貌进行透视。特别是高密度微阵列和基于测序的策略已经广泛用于确证肿瘤的遗传(如基因剂量,等位状态,和基因序列突变)和表观遗传(如DNA甲基化,组蛋白修饰和microR-NA)异常。尽管这些一维表达谱技术的应用对于癌基因的发现有所帮助,但受低频率事件影响的基因常被忽略。而多维平行分析的整合手段能够证实通常受多种机制干扰,但在低频率时受单一机制和组分影响的基因和通路。利用平行整合的多维手段研究肿瘤基因组,能够对驱动肿瘤细胞的关键基因和通路有更深入的了解。

生物芯片(bio-chip)是近年来发展起来的一种高通量分析工具,在各种组学,如转录组学、代谢组学以及表型组学研究中发挥着重要的作用。生物芯片的广泛应用也促成了一些新的学科如系统生物学的出现,为肿瘤生物学研究带来了新的希望。例如目前应用较广泛的一种生物芯片—DNA芯片,可用于基因诊断、基因表达分析、新基因发现及各种病原体的诊断等。由于生物芯片技术可以对DNA,RNA和蛋白质进行高通量分析,为肿瘤的分子生物学研究提供了一个良好的工具。

1突变和多态性检测

肿瘤细胞的基因突变和多态性是肿瘤分子生物学的重要特征之一,以往研究突变和多态性多采用PCR-SSCP,手工或自动测序、异源双链分析等方法,所有这些方法都无法进行大规模和自动化的分析,而DNA芯片技术可克服这些不足。

Hacia等(1996)用寡核苷酸芯片检测乳腺癌基因BRCAI第11个外显子(3.45kb)内所有可能的杂合性突变,包括碱基替换及小的插入、缺失等,并据此确定发病风险。在分析的15个病例中,14例为阳性,而20例对照均未出现假阳性,同时检出8个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)。尽管BRCAI基因可在22个编码外显子内发生突变,但是他们仅有5592个碱基组成,因此,有可能制造一个合适的芯片来检测出所有可能发生的突变。单核苷酸多态性(SNPs)广泛存在于各种生物基因组中,根据其在基因中的位置,可将SNPs分为外显子SNPs(eSNPs),内含子SNPs(iSNPs),和启动子SNPs(pSNPs)。在编码区域(cSNPs)和调节区域(rSNPs)的SNPs对基因功能最可能有影响。根据但核苷酸替代对功能影响的表现,可分为未知功能SNPs,候选SNPs和蛋白质SNPs。现在许多生物信息学资源和分析工具已经开发出来用于SNPs研究,例如:FlySNPWebsite,JSNPdatabase,SNPseek,SNPbrowserSoftware,SNPsFinder,GeneSNPsdatabase,SIMP,MouseSNPs,SeattleSNPs,ForensicSNPInformation,SNPselector和ssSNPer等。

DNA芯片技术用于基因组研究可创建第三代遗传图。Wang等用芯片技术鉴定出3241个单核苷酸多态性(SNPs),并构建了2227个SNPs的遗传连锁图谱。个体SNPs基因型可为评价疾病易感性和治疗优化选择的基础。在人类基因组中大约1kbp出现一个SNPs,若能将所有SNPs信息装入DNA芯片中,则可检测肿瘤患者与正常人以及不同肿瘤患者遗传背景的差异,为肿瘤的发病机理提供遗传学依据。

2基因诊断与肿瘤基因表达模式

将正常人基因组DNA和肿瘤病人基因组DNA与DNA芯片上的微阵列进行杂交,可分别得到标准图谱和肿瘤的病变图谱。通过两种图谱的比较分析,可以得到肿瘤的DNA信息,突变、缺失等异常发生在何部位?属于什么样的异常?得出正确的判断后就可针对病变的靶序列设计基因药物或基因疫苗,改变靶序列的表达情况,达到治疗的目的。表达谱芯片以其大规模、高通量和并行处理的优点,为研究肿瘤发展中的基因开关及表达程度提供了强有力的工具,并可随时获得肿瘤细胞生长各期与肿瘤生长相关基因的表达模式,从而使肿瘤的分子分型成为可能。

利用基因芯片获取基因表达数据,采用eQTL作图方法筛选cis-或trans-转录调节因子,对于了解肿瘤生长相关基因的表达调控方式,构建基因调控网络以及认识肿瘤发生机制都十分重要。

3基因组分析及发现新基因

Welford等应用代表性差异分析结合微阵列杂交检测了两例不同生物学活性的Ewing’s肉瘤组织,一例为进展和转移较快,另一例局限且治疗效果良好。两类肿瘤组织的mRNA经反转录成cDNA后首先进行RDA,RDA后的产物用“鸟枪法”克隆入质粒载体扩增后高密度排列到玻片上制成芯片。RDA方法可提供差异表达基因的浓聚库,与cDNA芯片联合则可以同时、快速、可重复地筛查上万种DNA分子,从而获得差异表达基因库。

Yang等应用抑制性消减杂交结合DNA芯片技术对ER阳性和ER阴性的乳腺癌细胞系基因差异表达进行了研究。经过序列分析发现4个克隆分别为细胞发育因子19(cytokeratin),GA-TA-3,CD24和谷胱甘肽-S-转移酶u-3,另外4个克隆与两个基因的EST序列一致,其余2个克隆为新基因序列。国内上海血液病研究所应用DDPCR和DNA芯片技术研究全反式维甲酸对急性早幼粒白血病细胞株NB4作用前后基因表达谱的变化,发现169个基因上调或下调,其中8个是未知的新基因。从上述研究中可以看出DNA芯片技术分析基因在不同时空表达及发现新基因方面是一个非常有效的技术。

4生物大分子相互作用研究

蛋白质芯片的作用原理同酶联免疫吸附测定(ELISA)。蛋白质芯片不仅可以检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用,而且还可以测定蛋白质与DNA,RNA,配体和其他小分子化合物之间的相互作用,在肿瘤和其他疾病中可用于药物靶向的研究与新药的研制,同时也可用于自身免疫性疾病的诊断。德国学者Leuking等用人胎脑cDNA文库hExl中的92个表达克隆产物及4例对照标木制成的蛋白质芯片与单克隆抗体RCS-His孵育,检测RCS-His6标记融合蛋白在每一克隆的表达。在92个hEXI表达克隆中有54个克隆的插入序列与GenBank登记的人类基因序列一致。Leuking等人仍用上述蛋白质芯片分别与人类三磷酸甘油醛脱氢酶(APDH)、热休克蛋白90a的羧基端片段(HSP90a)和a-微管蛋白相应的单克隆抗体反应,以观察单克隆抗体的特异性。蛋白质芯片可用于检测已知抗体的特异性;另一方面根据抗体的交叉反应可以发现蛋白质相互作用的新途径,特别适用于配体—受体及药物作用机制的研究。

MacBealh等根据DNA微阵列原理,设计出了蛋白质微阵列(Proteinmicroarray)。与微阵列上样品共孵育的蛋白质、酶作用的底物或小分子物质分别标有不同颜色的荧光基团,反应结束后采用通用的激光共聚焦扫描分析系统进行检测,这不但提高了检测的信息量:而且整个操作过程简单易行。

肿瘤生物信息学研究方法

21世纪是生命科学的时代,生物信息学为生命科学的发展提供了便利和强有力的技术支持,具有重要的基础研究价值。在应用研究方面,生物信息学在寻找人类疾病基因、预测基因和蛋白质表达的结构及功能和合理设计药物等方面都起着至关重要的作用。过去几十年,已经收集了大量有关癌症分子和遗传特征的信息。这些知识主要是基于还原论途径,同时癌症也被认为是“系统生物学疾病”。而复杂的生理过程不能通过简单地了解各个部分的功能来认识。不能用现有的处理复杂问题的方法将所有知识进行整合,还必须考虑生物网络:复杂问题的了解不考虑基因组之外的影响是不可能的。系统生物学将实验的多变量数据与数学和计算机方法相结合,模拟生物系统进行假设检验,或从高通量数据来说明未知的东西。代谢组学可建立基因型和表型之间的连接,提供信息以对病理机制和代谢表型进行全面了解,为新的靶向药物提供筛选工具。人们越来越清楚,所有复杂性状都受控于多个基因,涉及分子相互作用网络。IntNetDB正是基于类似的思想为研究基因相互作用而编制的数据挖掘工具。徐兴兴等通过IntNetDB找到基因PPP4R1的伙伴基因,应用CFinder工具找其社团基因,Chilibot在线工具分析社团基因与肿瘤的关系,继而推测PPP4R1与胃癌的联系。

1986年,华盛顿大学的Swanson教授提出了基于文献的知识发现(Literature-basedDiscovery)的理论,指出非相关的生物文献中可能隐含着大量的不为人知的科学知识(UndiscoveredPublicKnowl-edge,UPK)。目前,对生物医学文献的挖掘研究已成为生物医学领域的研究热点,应用到生物医学研究的各个领域。通过文献挖掘的方法以及生物信息学的分析可以发现蕴藏在文献中潜在的知识。

李铁求等(2009)通过FACTA工具从PubMed找出前列腺癌的相关基因进行分类,利用GATHER、PANTHER、STRING和ToppGene等在线工具对雄激素非依赖型前列腺癌特异表达基因进行生物信息学分析。筛选雄激素非依赖型前列腺癌特异基因128个,这些特异表达基因在细胞信号转导、凋亡、肿瘤生成、细胞粘附、细胞增殖和分化等生物学过程起着重要作用。通过生物信息学对雄激素非依赖型前列腺癌特异表达基因的挖掘发现,MMP9、EGFR、MMP2、ADM、MIF、IGFBP3、IL2、MET、BAD、RHOA、SPP1、EP300、SMAD3、RAF1、PTK2、TGFB2等基因在雄激素依赖型转变成非依赖型前列腺癌中可能起着重要作用。建立独立的肿瘤相关的生物信息数据库可以更好地为肿瘤的研究提供支持。如美国癌症研究院(NCI)的小鼠肿瘤生物学数据库(MTB,http://tumor.informatics.jax.org,强生研究院的小鼠数据库和人类肿瘤联盟的小鼠肿瘤模型数据库,法国的国际癌症研究院(IARC,http://www.iarc.fr/)的人类肿瘤和细胞p53基因突变数据库,斯坦福大学的SMD(http://genome-www5.stanford.edu/)数据库、耶鲁大学的YMD数据库和欧洲生物信息学研究院(EBI)的ArrayExpress数据库等。利用EST数据库对全基因组进行肿瘤差异表达基因的生物信息学筛选,是一种经济快速有效的筛选方法。对肿瘤标志物的鉴定具有重要意义,为肿瘤差异表达基因的筛选策略提供了新的思路。

利用gPET配对末端策略,EdisonT.L等将作图精度提高到100bp,MCF7乳腺癌细胞系基因组结构图对癌基因组所有可能的遗传重排提供了详细综合的注释。为了进一步分析,EdisonT.L等将MCF-7全长680,000bp的cDNA克隆定位到同一细胞系的gPET重排图谱上。重叠被认为是导致融合转录的部分有效重排。该研究组已经证实了近450个可产生可变转录的假想重排,约75个达到了多标签水平。

在基因组水平对于肿瘤相关基因进行扫描和筛选,可以很快地找到肿瘤易感基因和发病基因,同时依据生物信息学手段,可以很快地设计出针对这些靶标的治疗药物。因此,随着生物信息学在肿瘤研究方面的应用,人类将逐渐认识肿瘤发生的分子机制,为抗肿瘤药物的设计和研究提供参考,使人类将会有更好的手段去预防和治疗肿瘤。

展望

肿瘤表观基因组学是近年来发展较快的领域,特别是对于肿瘤的治疗,新的靶向药物设计和研究有重要的作用,发生在染色体上的表观遗传修饰与肿瘤的发生有密切关系,因此,对DNA、组蛋白的甲基化和乙酰化修饰以及染色质重塑复合体的作用机制的研究对揭示基因转录的调控、基因表达的抑制、DNA重组、复制和损伤修复以及肿瘤等一些疾病的发生发展有极为重要的意义,为制定肿瘤的治疗策略和开发新的抗肿瘤药物提供可靠的科学依据。

蛋白质在肿瘤的发生、浸润和转移等方面有很重要作用,而后基因组时代对蛋白质生物功能的研究将对基因组中功能基因的认识提供很有价值的信息,因此蛋白质功能方面的研究必将成为生命科学研究的重点。生物芯片技术已被证明可以进行基因诊断、基因表达研究、发现新基因、蛋白质与蛋白质以及蛋白质与其他生物大分子的相互作用等众多领域的研究,具有广阔的应用前景。但是生物芯片是众多学科许多技术相互融合、相互渗透的结果,对生物芯片数据信息的处理还需要有功能完善的生物信息学软件的辅助,在某些技术方面仍不甚完善,要成为实验室或临床可以普遍采用的技术仍有一些关键问题待解决。

分子科学论文:肿瘤的分子科学研究趋向

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