蛋白质组学研究及应用范文

1寻找差异表达的蛋白质

在疾病基因组的研究中,为了寻找差异表达的疾病相关基因或蛋白质,除了采用传统的分子生物学方法,如差减杂交[1]、抑制性差减杂交[2]、差异显示PCR法[3]及基因表达串联分析技术(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)[4]外,还可采用蛋白质组学的方法,即从蛋白质入手寻找新的或疾病相关基因或蛋白质。基因和蛋白质间并没有一一对应的关系,有mRNA,不一定能表达为有功能的蛋白质。但是,基因要表现其功能,一定要通过相应的蛋白质。所以,研究基因,特别是疾病相关基因,可从研究其表达蛋白质的结构或功能入手。常见的几种研究差异表达蛋白的蛋白质组学方法包括蛋白芯片技术、双向电泳技术、多维液相色谱技术以及它们和质谱鉴定的有机结合。

1•1蛋白质芯片技术

继基因芯片以后,蛋白质芯片技术逐渐发展起来。基因芯片又叫DNA芯片,是以DN段为材料的,而蛋白质芯片以蛋白质或多肽为材料。利用蛋白芯片技术能同时从微量的样品中检测成千上万个蛋白质或多肽,用于分析差异表达的蛋白质及药物靶标的鉴定,所以,蛋白质芯片在药物基因组学的研究中发挥着极为重要的作用。众所周知,蛋白质不如核酸稳定,在蛋白质样品的处理中将会遇到很多困难,对蛋白质芯片的操作将比对基因芯片的操作要求更为严格。从基因组测序知道,仅有约30000~35000个基因维持人体正常的生理作用[5],由于RNA编辑及翻译后修饰等因素,使得人体细胞的总蛋白质数目(蛋白质组)远远超过有活性的基因数目。因此,能同时检测成千上万蛋白质的蛋白质芯片技术,是唯一可用来有效研究人体蛋白质组的方法。目前,主要将蛋白芯片和表面增强的激光解吸离子化质谱技术(SELDI-MS)相结合寻找差异表达的蛋白质。其原理是将不同生理状态的样品(培养的细胞或组织样品)和同一蛋白芯片结合,洗去未结合的蛋白质,然后用SELDI-MS分析结合的蛋白质。一般来说,每种芯片可特异地结合某一细胞特定的蛋白质。具体的操作方法随不同厂家生产的蛋白芯片不同而异。LiX及其同事[6]将小鼠MRL的耳朵穿刺,观察耳朵上伤口愈合过程中蛋白质表达的变化情况,用蛋白芯片分析的结果表明,分子量为23•56ku的蛋白在伤口愈合过程中表达量大幅度增加,加速了伤口的愈合。尽管蛋白质芯片技术正逐渐得到广泛应用,但在应用于寻找差异表达蛋白时也有局限性:1)待检的低丰度蛋白往往被高丰度蛋白所掩盖而不能检测出来,2)蛋白质芯片系统对检测小分子量的蛋白有效,检测范围为10~30ku,但是10~30ku的蛋白只是占总蛋白的一小部分。

1•2多维分离技术对于复杂的蛋白质样品,比如特定组织或细胞中的所有蛋白质(蛋白质组),仅靠某一分离原理将它们分开是不可能的,而要利用蛋白质的不同性质将它们分离开,由此而发展起来的分离技术叫多维分离技术(multidimensionalseparation)。目前主要采用的是二维分离技术,因为对于大多数蛋白质的分离,采用蛋白质间某两个性质的不同,利用二维分离技术已足够了。其中,双向电泳技术和二维液相色谱以及它们和质谱的联用,已成为当今蛋白质组学研究的有力工具。

1•2•1双向电泳技术:双向电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)技术是80年展起来的一种有效的二维分离技术。其原理是基于不同蛋白质的等电点和分子量不同的特性,第一相是等电聚焦电泳,第二相是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。很多实验室利用不同的双向电泳技术建立了特定组织或细胞的双向电泳数据库(2DPAGE),以供不同的实验室检索和比较双向电泳图谱。SWISS-2DPAGE是一个经注释过的双向电泳公共检索数据库,其格式和SWISS-PROT蛋白序列数据库类似。在SWISS-2DPAGE数据库中包括蛋白质的双向电泳图谱(其中标明了蛋白质的具体位置)、建立图谱的具体方法和程序、以及相关的病理和生理数据。关于蛋白质的双向电泳数据可通过如下服务器进行检索:expasy•hcuge•ch/。在功能基因组时代,双向电泳技术除了用于分离复杂的蛋白样品,建立双向电泳数据库外,主要用于寻找不同组织或细胞中差异表达的蛋白质,以进行疾病相关蛋白或基因的研究。先用pH3-10的IPG胶条,对疾病组织和正常组织进行双向电泳分离,然后利用计算机软件对所产生的2-DE图谱进行分析,找出差异表达的蛋白。

如果想得到更为详细的2-DE图谱,可用pH4-7或pH6-9的胶条,甚至只有一个pH单位的窄pH范围的胶条,从而使分辨率大大提高。将找到的差异表达蛋白斑点从胶上切下来,经酶消化(常用胰蛋白酶),通过质谱(MS)或串联质谱(MS/MS)测定和数据库搜索,鉴定出所差异表达蛋白。然而,双向电泳技术有许多局限性,由于样品处理的差别、翻译后修饰、人为修饰等导致同一基因表达的蛋白质迁移到不同的位置;另外,不同的蛋白也会迁移到同一斑点,出现共迁移现象,从而使得用2-DE进行定性和定量分析变得相当复杂。而且,对于低丰度和低拷贝数蛋白的检测也相当困难。双向电泳要求操作者熟练掌握电泳、染色及软件分析技术,整个实验过程中要穿实验服,戴手套,尽量避免角蛋白等污染,才能得到较好的重复性。为了改进双向电泳的重复性和灵敏度,最近发展了一种荧光染料标记的双向电泳技术即凝胶内差别电泳(differentialin-gelelec-trophoresis,DIGE)[7]。

将样品和对照品分别用1-(5-羧戊基)-1′-丙基靛碳氰卤化物(Cy3)N-羟基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-propylindocarbocyaninehalinge(Cy3)N-hydroxy-succinimidylester]和1-(5-羧戊基)-1′-甲基靛碳氰卤化物(Cy5)N-羟基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindocarbocyaninehalinge(Cy5)N-hydroxy-succinimidylester]标记。在DIGE时,由于样品和对照在同一胶内分离,使用相同的内标,避免了使用不同凝胶时在操作上的偶然性和不平行性,可以准确检测出两个不同样品蛋白表达上的差别,消除胶与胶之间的差异,保证统计上的可靠性及操作上的重复性。荧光标记较其他染色方法灵敏度更高。与常规的双向电泳技术比较,DIGE更加简单,劳动强度大大降低,效率大大提高。

1•2•2多维液相色谱-质谱技术:液质联用质谱仪用于小分子和大分子的分离和鉴定是一项常规而重要的技术,将液相色谱和质谱用于蛋白质组的研究,尤其是差异表达蛋白质组的研究,是最近才发展起来的。目前,利用多维液相色谱-质谱进行差异表达蛋白的研究,通常要借助于同位素标记技术,也即是下面所述的ICAT技术。ICAT技术是指采用同位素标记多肽或蛋白质的亲和标签技术(isotopecoded-affinitytags,ICAT),可以较准确的鉴定出不同状态细胞或组织中差异表达的蛋白质。目前的ICAT试剂,大多是用来标记磷酸化蛋白的[8]。对于酵母和细菌细胞,可在培养基中加入同位素进行标记。另外,在蛋白酶解的过程中,可采用18O对蛋白样品的片段进行标记,而对照品不用同位素标记。当使用胰酶、Glu-C或Lys-C等蛋白酶时,可分别引入2个18O到正在被酶解的肽中。现在流行的市售ICAT试剂由美国华盛顿大学GygiSP教授[9]等人首先报道。此ICAT试剂的结构包括三个部分:生物素亲和标签,用于分离ICAT标记的多肽;中部的连接子,使引入的同位素更稳定;反应活性基团,可和半胱氨酸的巯基发生特异性反应。此试剂以两种形式存在,重试剂(含同位素氘)和轻试剂(不含同位素),前者的质量数比后者多8。利用ICAT试剂标记蛋白,寻找差异表达蛋白质的原理是:当样品和对照分别用重试剂和轻试剂标记后,将两样品混合,酶解,过链亲和素柱,使ICAT标记的肽片段吸附在链亲和素柱上。将ICAT标记的肽洗脱下来,经液相色谱-质谱分析。在质谱图上,表达量不同的样品和对照呈现特征性的质量数相差8的双峰(双电荷时质量数相差4,如质量数993•8和997•7)。

2疾病诊断与药物开发

蛋白质组学方法除了在基础医学研究中用于寻找差异表达蛋白质,进而找出疾病相关蛋白质外,在疾病基因组学与药物基因组学的研究中还具有以下几个方面的作用。

2•1鉴定和疾病相关的生物标记分子

蛋白质组学方法在基础医学研究中的优点在于,可以高通量的方式筛选和鉴定和疾病相关的生物标记分子,用于临床诊断。HeineG[10]等人利用脑脊液作材料,经过双向电泳分离后的蛋白斑点,用液相色谱-质谱分离鉴定,得到了脑脊液的高分辨率肽谱。因脑脊液的肽中包括许多激素、细胞因子和生长因子,在生物体中起着关键作用,它们以多种方式反映机体体内平衡中和疾病相关的变化,如果能从这些肽中鉴定出疾病相关的标记分子,将可从肽水平上调查中枢神经系统相关疾病,因而是一种疾病诊断和治疗的新方法。KuererHM[11]等人利用高通量的双向电泳技术,分析乳腺管流体(breastductalfluid)中生化和细胞成分,以监测乳腺癌的发生和进展情况。BrunagelG[12]等人则根据核基质蛋白和结肠癌的相关性,利用双向电泳技术鉴定病人的肝样品中是否有核基质蛋白,从而判断结肠癌病人是否发生肝转移,以此作为结肠癌肝转移的早期诊断。对于蛋白芯片技术,在基础研究中常用于检测蛋白质修饰、表征蛋白质相互作用、信号传导以及酶动力学研究等。在临床上,广泛用于寻找疾病相关的生物标记分子和疾病诊断。WuW[13]等用SELDI-蛋白芯片技术鉴定了来自同一病人的两种头颈部鳞状细胞癌细胞株HBSCC10A和VMSCC10B中蛋白的差异表达。结果发现,α-烯醇酶、annexin-Ⅰ和annex-in-Ⅱ是头颈部鳞状细胞癌发生和转移的重要分子,以这些分子作为生物标记分子,用于头颈部鳞状细胞癌的临床诊断。对于多维液相或毛细管液相色谱-质谱技术,由于可进行连续和微量检测,在寻找疾病相关的生物标记分子方面具有超强的灵敏度。可进行大体积、低丰度蛋白的分析,如对血清样品[14]和尿液[15]进行蛋白质组学的研究。

2•2药物开发

因为蛋白质直接决定生物体处于健康或疾病状态,所以,蛋白质可作为药物设计和开发的药靶。利用蛋白质组学方法研究健康或疾病生物体蛋白间的相互关系、疾病病理基础、鉴定药物成分、毒性和作用机理,从而改进药效和药物安全性。MujerCV[16]等利用双向电泳和质谱技术,分析了布鲁氏杆菌(Brucellamelitensis,BM)的蛋白质组。BM是一种细胞内兼性革兰氏阴性杆菌,可引起人或动物的布鲁氏热(brucellosis)。此杆菌的一个属中至少有6个种。利用双向电泳和质谱技术,分析了BM致病株16M的蛋白表达模式,并鉴定了所有表达的蛋白质,对6种布鲁氏杆菌减毒疫苗Rev1的蛋白图谱进行了广泛研究。从而为发展疫苗,鉴定致病岛(patho-genicityisland),建立宿主专一性、进化相关性及疾病治疗和药物开发奠定了基础。

2•3致病机理研究

用蛋白质组学方法研究疾病发生发展过程中某些蛋白或多肽水平的变化,从而了解疾病发生的机理,如对慢性髓性白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)分子机理的研究[17]。此病为造血干细胞疾病,标记分子为Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶。让全能的骨髓干细胞株(FDCP-Mix)有条件的表达Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶,从而使FDCP-Mix细胞株长期暴露于Bcr-Abl中,模拟CML疾病进程。用长期暴露和短期暴露进行对照,用MALDI-Tof质谱或LC-MS进行鉴定。分析结果表明,白三烯(Leukotriene)A4水解酶的表达上调,AnnexinⅥ、液泡ATP合成酶催化亚单位A及mortain的表达下调,表明这些分子在CML的发生中发挥重要作用。将蛋白质组学方法用于疾病机理研究的例子很多,这里不再赘述。

3结束语

随着蛋白质组学技术发展的日益成熟,其在疾病基因组和药物基因组研究中的应用将越来越广泛。人们不仅可以找到疾病相关的基因,还可搞清楚疾病发生的机理,鉴定出疾病相关的生物标记分子,以便用于临床诊断。在药物设计中找到合适的药靶,开发出高效快捷的药物,用于疾病治疗。可以预见,在不久的将来,许多危害人类的顽症,如糖尿病、艾滋病、高血压等,将会随着人类基因组的破译和蛋白质组功能分析的完成而被彻底攻克。