脑细胞间液药理学的研究范文

脑细胞间液（Braininterstitialfluid,BIF）又称脑细胞外液（Cerebralextracellularfluid,CEF），是存在于脑神经细胞之间的体液。它是神经元生存的直接外环境，也是脑靶向药物成分透过血脑屏障作用于神经细胞的主要途径，脑细胞间液中包涵了神经元和胶质细胞释放到胞外的内源性物质，是检测入脑药物成分的理想对象。基于上述理念，本课题组提出脑细胞间液药理学的研究思路，采用微透析技术收集脑细胞间液，检测其中药物有效成分和内源性成分如神经递质等的变化，并研究其对细胞或组织等模型的药效和作用机制。脑细胞间液药理学用于脑保护中药复方的有效物质筛选和机制研究，具有重要的意义和明显的优势。

一、脑细胞间液药理学的概念

自田代真一等[1]首次提出“血清药理学”的概念以来，逐渐形成了应用此种方法研究中药药理的趋势。但由于血脑屏障将大脑与外周严格区分，从而致使神经细胞的微观生存环境和屏障以外的其它体细胞有很大差别。首先，血清药物成分与能进入脑组织中的药物成分也存在较大差异。血脑屏障控制着物质的转运，保证中枢神经系统内环境的高度稳定。完整的血脑屏障是一个复杂的细胞系统，由血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞、神经元和细胞外基质共同构成，这一特殊结构可使血液中多种溶质从脑毛细血管选择性的进入脑组织。

其中，内皮细胞间的紧密连接、基底膜及星形胶质细胞的终足形成了BBB的3道机械屏障，而转运系统和药物代谢酶构成了其酶屏障。水溶性药物受到机械屏障的阻止，不能进入血脑屏障。脂溶性药物的跨膜转运受血脑屏障表面的多种转运体控制，转运体的表达受癫痫或炎症等因素影响，间接影响到脂溶性药物成分的透过率[2，3]。

其次，血清和脑细胞间液的基质物质不同。从该层意义上来讲，将含药血清用于神经元的培养并不恰当，已有实验证明含药血清对神经细胞有毒害作用[4]。所以，脑保护药物研究不适用血清药理学的方法，只能寻求其它手段。梅建勋等[4]提出脑脊液药理学的概念，采用正常家兔给予受试中药，然后从小脑延髓池穿刺采集脑脊液，用于神经细胞培养。结果显示，含药脑脊液有一定的神经营养作用。由于脑脊液与脑细胞间液存在交换，研究脑脊液中化学物质的变化，一定程度上可以反应血脑屏障通透性的变化[5]，但不同药物在脑脊液与脑细胞间液中的药物浓度存在差距。LiuX等[6]分别采用微透析法和抽取脑脊液的方法，检测了戊硫代巴比妥、9-羟利培酮等9种药物在脑细胞间液和脑脊液中的含量，结果9-羟利培酮在脑脊液中的浓度是微透析液浓度的5倍，其余8种药物脑脊液中浓度均在微透析液浓度的3倍以内，证明脑脊液中药物成分也有异于脑细胞间液。血-脑脊液屏障位于脑室脉络丛的血液与脑脊液之间，其结构基础主要是脉络丛上皮细胞之间有闭锁小带相连，与血-脑屏障相比结构疏松，存在渗漏的小孔，故脑脊液与血液间存在丰富的物质交换。进入脑脊液的小分子示踪剂按时间顺序依次在血管、毛细血管、引流静脉和脑细胞间液中被检出，这证明脑脊液与脑细胞间液的交换相比血液与脑脊液的交换更慢，这是因为脑脊液中的成分要进入脑组织间隙需要通过紧密连接，相比之下交换较为困难[5]。

基于上述研究，本课题组提出脑细胞间液药理学的研究思路。实验动物口服或静脉给药后，采用含有药物成分的脑细胞间液，研究对细胞或组织等模型的药效和作用机制，即脑细胞间液药理学。脑细胞间液是神经细胞生存的直接外环境，也是药物成分透过血脑屏障作用于神经细胞的必经途径，故脑细胞间液是检测透过血脑屏障药物成分的最佳载体。参照血清药理学，检测脑细胞间液中药物成分，并以其作为干预因素进行体外实验是脑细胞间液药理学的主要内涵。

二、建立脑细胞间液药理学的关键技术

微透析（Microdialysis）是灌流采样与透析相结合的新型生物采样技术，诞生于20世纪70年代，最早用来测定脑内神经递质的含量。因微透析具有活体微创、可动态观察、采样量小的特点，在生命科学研究中应用越来越广泛。尤其在能透过血脑屏障药物的药代动力学、生物利用度等研究中，微透析技术成为不可或缺的手段之一[7]。微透析技术用于脑细胞间液药理学的优点如下：①微透析可以用于实验动物的活体采样，且对动物的伤害较小，属于微创手术。在采样过程中可以保持小型动物（大鼠、小鼠）清醒活动状态，收集的数据能较为真实地反映动物的活体生物指标，不受大面积创伤、麻醉等激烈刺激的影响；②微透析样品可以实时反映透析液中待测物的变化情况，以浓度为纵坐标，时间为横坐标描绘待测物的量-时曲线，可以直观地反映待测物含量的变化趋势。若是微量样品以微柱测定，时间间隔甚至可以缩短到3min，避免待测物因降解所造成的测定不准确；③样品中无大分子物质，基本不需处理可直接分析。由于微透析样品经对大分子无通透性的半透膜透析得来，蛋白质等大分子都被截留膜外（可透过分子量约为5000~50000Da），样品可以直接由液相色谱、质谱等精密仪器分析，省时高效，避免样品处理过程中损耗、引入其它杂质所造成的数据偏差；④脑微透析液可直接反映脑细胞间液中的药物水平，在透析取样过程中，由于与蛋白结合的药物不能穿过半透膜，所以微透析样品中所得的游离型药物浓度更能体现与药理作用的相关性；⑤微透析液是与神经细胞外环境组成高度相似的基质，从药物或内源性成分的组成都适用于神经细胞的体外实验。因此，微透析技术为脑细胞间液药理学提供了技术保障。

三、脑细胞间液药理学用于中药复方研究的优势

1.有助于中药复方有效成分的靶向性筛选

中药复方是中医临床用药的主要形式，体现了中医药的特色与优势，同时，中药复方的研究也充满了复杂性，其作用规律及作用机制研究引起世界学者的兴趣[8]。本课题组认为，对中药复方有效成分的研究必须与其特定功效紧密结合，具体问题具体分析[9]。我国学者王喜军等进行了大量的血清药物化学的实践研究工作，他从血清中分离、鉴定移行成分，研究血清中移行成分与传统疗效的相关性。中药归经学说认为，药物的功效与其归经密切相关。受上述启发，我们认为复方的有效成分也应与其代谢分布密切相关。靶向性筛选有助于研究中药复方有效成分，即通过研究靶器官的药物蓄积、代谢情况，为阐述药物有效成分提供依据。针对脑血管疾病治疗过程中的血脑屏障难题，药物透过血脑屏障的靶向性研究是筛选脑保护中药的重要途径。虽然有研究表明中药可通过作用于内皮细胞间接干预脑实质的病理变化[10]，但通过血脑屏障，直接作用于脑实质是脑保护药物的主要作用途径[11，12]。对治疗脑部疾病的中药化学组分进行靶向性筛选，检测通过血脑屏障进入脑实质中的药物组分，有助于发现中药的脑保护物质基础。如本课题组研究了由3味中药组成的复方塞络通胶囊（原：维脑康），给药后大鼠脑微透析液中的药物成分来源于其中两味中药的3种成分。

2.有利于动态观察脑内药理指标的变化

脑缺血等疾病发生后，脑细胞间液中兴奋性氨基酸、单胺类神经递质和乙酰胆碱等内源性物质含量发生变化，反映了疾病进程和病变机制。对脑细胞间液中上述内源性生物活性物质的检测，是研究脑病发病机制和治疗药物的重要手段。如通过采用微透析技术研究脑细胞间液中兴奋性氨基酸的含量，发现兴奋性氨基酸异常释放是脑缺血后的关键病理环节[13]，且一些治疗药物对此有抑制作用[14，15]。

另外，儿茶酚胺类神经递质（DA和NE）、5-HT及乙酰胆碱的释放增加与很多脑病发病机制相关[16，17]。基于微透析技术，检测上述神经递质在脑细胞间液中的含量变化可以动态、连续的反映其病理变化。

3.有利于体外研究中药复方的作用机制

因脑细胞间液是神经细胞的真实生存环境，采用微透析技术采集的样品是脑细胞间液的稀释液，故微透析液体外培养神经细胞理论上存在可能。本课题组对MCAO大鼠给予复方中药治疗，收集脑微透析液进行体外药理实验。前期研究表明，采用含40%正常脑细胞间液的培养液，对正常和受损神经元的生存率和LDH释放率均无显著干预作用，而加入同样浓度的含药脑细胞间液，对受损神经元有显著保护作用[18]。采用含药微透析液，相比直接采用药物或药物有效成分进行体外细胞实验，具有如下优点：①中药复方制剂多为汤剂、胶囊、丸剂等，在加入培养液前的溶解、过滤等环节均存在较大困难，而微透析液中多为小分子物质，仅过滤除菌即可应用，其成分不会发生改变；②微透析液中的药物成分是复方经吸收、代谢、透过血脑屏障后到达作用部位的实际状态，更接近药物在临床中的应用；③中药复方有可能作用于神经元外的其它细胞而发挥作用，如促进星型胶质细胞分泌神经营养因子，而脑细胞间液体现了给药后脑内的内源性分子改变，所以可更全面体现复方的脑保护功效。

4.反映病理状态下血脑屏障透过率的改变

在血清药理学研究中，人们注意到中药复方进入生理状态下的动物机体与进入病理状态的动物机体，其体内过程是不一致的[19]。在病理状态下，药物通过血脑屏障的透过率也不同于生理状态。脑缺血引起炎症反应、蛋白酶激活、氧自由基产生等一系列的病理变化，会导致紧密连接的破坏和血脑屏障通透性的增加，有些药物较生理状态时更容易进入血脑屏障[2]，如银杏内酯B在缺血侧半脑的药物浓度显著高于健侧[20]。但有些药物与之相反，如Spudich等[21]发现在局灶性脑缺血发生后，脑毛细血管内皮细胞的抗药转运体Mdr-1表达明显上调，造成某些药物透过血脑屏障明显受阻。所以，脑缺血中风治疗药物的靶向性研究应在其相应病理模型上进行。另外，给药剂量也应按临床正常用量进行人与动物给药剂量换算，既与临床用药规范相符合，又不会改变药物代谢及与机体间的相互作用[1]。

四、脑细胞间液药理学尚须解决的问题

病理状态下血脑屏障通透性发生改变，脑细胞间液中药物含量与生理状态下有所不同，更接近临床实际。从筛选药物靶向性物质基础的角度，应采集病理模型动物的微透析液进行分析。但因病理状态下，微透析液中内源性毒性物质含量也同时增加，如微透析液中兴奋性氨基酸含量会增加至正常水平的数十甚至数百倍，对神经细胞具有毒性作用。故病理状态下微透析液不能直接用于体外神经细胞培养。寻求一种既能体现临床实践中透过血脑屏障的药物成分含量，又能除去毒性因子的干扰的方法是使脑细胞间液药理学进一步发展的途径。本课题组已经对脑细胞间液药理学进行了初步实践，但其具体方法还有待进一步完善。

总之，脑细胞间液药理学的提出为脑保护中药复方的研究提供了一种新方法和思路，尤其在复方中药有效物质筛选和体外机制研究方面存在较大优势，具有明显的创新意义。目前应用该模式研究中药复方塞络通胶囊取得了初步的结果，但做为一个新型的方法还存在一些不足，有待进一步研究。