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聚氨基酸载体研究进展

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现代药物传递系统的研究离不开新型材料的使用,特别是药用高分子材料,壳聚糖、透明质酸、明胶、淀粉、海藻酸钠、白蛋白、纤维素、聚乳酸、聚乙烯醇、丙烯酸类、聚酯、聚醚类等已在药剂学中展现出独特的优势。但生物相容性、生物降解性和安全性制约了部分药用高分子材料的使用,开发安全的且具有新型功能的高分子材料一直是药剂学研究的热点领域。氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位,是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。选用一种或多种氨基酸合成聚合物能在体内酶的作用下降解为氨基酸,生物相容性好,且安全无毒,聚氨基酸的研究已受到广泛的关注。采用天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸等制备聚氨基酸是一类低毒、生物相容性好、容易被机体吸收、代谢的生物降解高分子,在医药领域如药物控释、人造皮肤等方面具有广泛的应用。目前聚氨基酸作为药物载体的研究主要集中在聚氨基酸-药物偶联物、聚氨基酸复合载体、氨基酸共聚物几个方面:聚氨基酸与药物通过化学键形成偶联物,在体内酸性环境及酶的作用下化学键断裂释放药物,达到缓释、靶向的作用,并且可以降低药物的毒性;聚氨基酸与其他高分子材料形成复合载体以克服单一材料的不足以及实现新的功能;氨基酸共聚物亦可形成两亲性材料作为药物载体,以提高药物溶解性能,延长体内循环时间和实现靶向目的。

1聚氨基酸-药物偶联物

聚氨基酸含有活性氨基和羧基端,可以通过共价键与药物结合,形成偶联物,该偶联物在体内特定酸性环境及酶的作用下化学键断裂释放药物,达到缓释、靶向的作用,同时由于聚氨基酸的保护作用,能够提高药物的稳定性,降低药物的毒性。聚氨基酸-药物偶联物研究起始于上世纪70年代初,美国犹他大学Kim领导的课题组曾成功地合成了聚谷氨酸材料,用氨基丙醇为侧链基,以共价结合方式与甾体避孕药炔诺酮形成偶联物,并进行了体外及大鼠体内释放试验,其释药时间达300余天。实验结果表明,聚谷氨酸可降解为单体并不在生物体内滞留。聚氨基酸含有活性羧基与药物通过酯键结合是较为常见。另外聚氨基酸还可以通过腙键与药物相连,因为腙键在低pH环境下时容易断裂,在肿瘤低pH环境下靶向释放。聚氨基酸与顺铂通过配位键结合或与生物药物结合可延长体内循环时间。但由于该类载体是通过药物与聚氨基酸共价键偶联,针对每一药物都需要设计合适的反应条件,并完成聚氨基酸-药物偶联物的制备,增加了实施的难度、提高了成本,因此在应用上受到限制。

1·1通过酯键结合

陈汐敏等[1]制备了新型天冬氨酸-谷氨酸共聚物-甲硝唑纳米粒,粒径为198·9nm,载药量达12%,1h与24h体外累积释放百分率分别为12·19%和47·51%。戚晓红等[2]制备了聚天冬氨酸-甲硝唑纳米粒,平均粒径为404·8nm,载药量高达30%,24h体外累积释放百分率为38·01%,并能持续释放达30d,研究结果表明,聚天冬氨酸-甲硝唑纳米粒显著提高甲硝唑对滴虫的抑杀作用。因此,聚天冬氨酸是一种非常有潜力的载体。

1·2通过腙键结合

研究表明肿瘤组织pH低于正常组织,而肿瘤细胞内更是偏酸性,内含体和溶酶体pH低至5·0,利用pH的不同设计pH敏感给药系统可以达到靶向的目的。Ponta等[3]将PEG-Pasp[poly(ethyleneglycol)-poly(asparticacid)]共聚物的天冬氨酸羧基与氨基乙酸甲酯或4-氨基苯甲酸甲酯的氨基反应再与肼反应后与阿霉素分子的羰基通过腙键共价键链接(腙键在弱酸环境易于解离),研究表明,不同相对分子质量比的氨基乙酸甲酯链接的聚合物PEG-Pasp在pH5·0条件下药物释放均明显快于pH7·4,如PEG与Pasp相对分子质量比为12∶5,PEG相对分子质量为12kD时,测定48h,pH7·4时药物释放30%,pH5·0释放40%。因此,该释药体系可使Dox在低pH条件下快速释放而聚集于肿瘤部位。

1·3通过配位键结合

聚氨基酸与含金属元素药物之间通过配位键结合,在体内缓慢释放,延长其体内循环时间。如NC-6004[4]为PEG-聚谷氨酸共聚物与顺铂的配位化合物,聚谷氨酸侧链羧基通过配位反应取代顺铂中氯原子后与铂原子结合,顺铂从NC-6004中24h和96h分别释放19·6%和47·8%,体内维持较长时间血药浓度,体内AUC0-t和cmax分别是顺铂的65倍和8倍。

1·4基因融合

简单的多肽链可以形成与PEG类似的空间伸展构像,将蛋白与多肽链融合,可以起到稳定蛋白的作用。多肽不仅比PEG能够提供更均匀同源终端产物、避免生产过程中PEG的化学链接,而且多肽的长度可以根据调整半衰期的需要精确调控。Schellenberger等[5]采用丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸制备多肽36氨基酸片断组成氨基酸随机序列文库,最终根据遗传学稳定性、溶解性、热稳定性、抗聚集性、以及杂质(宿主细胞蛋白、DNA、脂多糖)的多少,筛选出一种由864个氨基酸组成的多肽,将该多肽融合到新型降糖药Exenatide上,使其体内半衰期由原来的2·4h延长至139h。

2聚氨基酸复合载体

聚氨基酸与常用高分子材料通过化学键或物理作用结合形成复合载体,可以实现缓释、靶向、降低毒性、提高基因药物的转染率的目的。PEG与疏水性聚氨基酸形成两亲性聚合物,在溶液中可自动聚集成胶束,作为药物载体;聚赖氨酸带正电荷,与带负电荷的基因药物形成复合物,可提高载药量和转染效率,接上相应配体可以实现靶向目的;亦可选择合适聚氨基酸与阳离子材料壳聚糖通过电荷作用形成复合载体。聚氨基酸为两性离子,在不同pH条件下结构不同,亲水性能也不同,可与聚乳酸-羟基乙酸共聚物形成pH敏感复合载体。另外,亲水性氨基酸有类似PEG的性能,用以修饰其他材料后形成复合载体以达到长循环作用。该类载体在应用时存在如下几个方面问题:1)合成复合载体增加成本,如PEG与氨基酸组成复合载体,首先要将PEG的端基活化为氨基、羧基等活性基团,增加了生产工序;2)复合载体增大安全性风险:高分子材料如聚乙二醇、壳聚糖、聚乳酸等存在一定的免疫原性,联合聚氨酸后可能增强免疫原型;3)复合载体的载药性和降解性有待研究。因而这类载体目前尚未见产品面世。

2·1聚氨基酸与PEG组成复合载体

聚乙二醇(PEG)具有柔韧的亲水性长链结构,又可生物降解,利用PEG亲水性强,分子链柔性,能够包裹在聚合物胶束、脂质体或纳米粒等表面,从而使微粒给药制剂避开单核吞噬细胞的吞噬,达到长循环作用。利用聚氨基酸所带电荷不同、聚氨基酸的残基亲水性不同与PEG偶联后以达到提高载药量、缓释、降低毒性或制备成pH敏感型载体。

Prompruk等[6]以PEG为亲水段,天冬氨酸与苯丙氨酸(Phenylalanine)合成的聚合物作为疏水段,形成嵌段共聚物。天冬氨酸可以通过离子作用包载药物,而苯丙氨酸的疏水性或者芳环相互作用有利于胶束形成,减缓胶束解离,延缓药物的释放。制备的PEG-P(asp-phe)(相对分子质量比5∶6∶4)包载亲水性药物三氮脒,4h内释放35%,并可维持12h缓释。

Wang等[7]合成mPEG与聚N-氨基酸基-DL-天冬酰胺接枝共聚物制备纳米胶束,用于包载药物顺铂,结果可维持40h缓慢释放,并且可降低对Bel-7402细胞的毒性。选用带正电荷的赖氨酸(lysine)包载基因药物,以提高包封率和转染效率等是聚氨基酸应用研究热点之一。Park等[8]研究PEG接枝或共聚L-赖氨酸(polyL-lysine,PLL)后通过物理吸附包裹在腺病毒表面,由于血清蛋白表现负电性,可通过离子交换作用使PLL-g-PEG去PEG化,而药物释放腺病毒,再通过CAR中介的细胞内吞作用进入细胞,结果包裹的腺病毒相对表达水平最高达370%。因此,可以通过简单的物理包裹病毒,以提高转染率,减少先天免疫反应。

Choi等[9]制备PEG-聚(谷氨酸-苯丙氨酸)载质粒DNA复合物,转染效率是聚赖氨酸的80倍,细胞毒性试验结果显示,使用PEG-聚(谷氨酸-苯丙氨酸)细胞存活率达95%,而使用聚赖氨酸或者聚乙烯亚胺的细胞存活率分别为65%和55%。

采用聚氨基酸与PEG共聚作为抗肿瘤药物载体有NK012[10]已进行Ⅰ期临床研究,NK105已进行Ⅱ期临床研究[11]。NK105为PEG-聚天冬氨酸共聚物,通过疏水作用物理包裹紫杉醇,注射后血浆药物浓度可以维持72h,而单用紫杉醇24h后就已经检测不出;用药后5min血药浓度及AUC分别是紫杉醇的11~20倍和50~86倍;临床应用胶束(相当于紫杉醇25mg/kg)抗肿瘤活性与100mg/kg紫杉醇疗效相当。NK012为PEG-聚谷氨酸共聚物包载7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxy-CPT,SN-38),单用SN-38注射后浓度呈对数式速度下降,而HT-29肿瘤中使用NK102SN-38的清除率显著降低,SN-38浓度维持在30ng/g长达168h,并且NK102在小鼠体内的网状内皮系统表现高度聚集。

2·2与相应配体结合

聚氨基酸-PEG与相应配体结合可以实现靶向的目的。Kim等[12]制备聚赖氨酸-PEG两亲性嵌段共聚物,并以叶酸(folicacid,FOL)修饰PEG,形成带正电PLL-PEG-FOL聚合物,带负电荧光标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)与PLL-PEG-FOL形成聚电解质复合物,应用于叶酸受体过表达KB细胞,该体系FITC-BSA表现出高摄取,结果证实提高摄取是由叶酸受体产生的。试验者采用叶酸受体缺乏细胞A549研究表明,PLL-PEG-FOL/FITC-BSA摄取量并未增加,因此证实该给药体系可以通过叶酸受体达到靶向的目的。

Liu等[13]采用树状接枝聚赖氨酸-PEG-30肽(DGL-PEG-Leptin30,Leptin是内源激素衍生物,作为脑靶向配体)与血浆DNA制备纳米粒,运载基因药物穿过血-脑脊液屏障达到脑靶向作用。研究表明,DGL-PEG-Leptin30在体外实验中能够穿越血-脑脊液屏障模型,而静脉注射后可以在小鼠的脑内聚集。总之,DGL-PEG-leptin30/DNA是相当安全有效的脑靶向基因传递系统。

2·3与壳聚糖形成复合载体

壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的阳离子聚多糖,而氨基酸表现为两性离子,在生理条件下,不同氨基酸可表现为阳离子型或阴离子型,选择合适氨基酸能与壳聚糖通过静电作用形成分子间聚合物。Shu等[14]制备水溶性壳聚糖(water-solublechitosan,WSC)聚天冬氨酸-PEG复合物(WSC/Pasp-PEG),包载牛血清白蛋白,载药量最大可达40%左右,包封率最大90%左右。模拟体内环境pH1·2、2·5和7·4条件下体外药物释放研究,释放速度pH7·4>pH1·2>pH2·5,这是因为pH1·2时Pasp的羧基以-COOH形式存在,WSC与Pasp之间的静电作用力减弱,复合物不稳定,破裂后药物释放。在pH7·4时WSC的去离子化,导致纳米粒崩塌,药物快速释放;空腹胃内pH(pH2·5)时,药物缓慢释放。因此,建议餐前服用。

2·4与聚乳酸-羟基乙酸共聚物形成复合载体

聚乳酸-羟基乙酸共聚物也是药剂学中常用高分子材料,常作制备微球的材料。Yang等[15]将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚谷氨酸共聚(PLGA-b-PGA),制备成pH敏感聚合物,在pH3~9范围内,随着pH升高,该聚合物依次呈紊乱形态(pH3)、胶束(pH5)、伴有厚壁的半囊泡(pH7)、囊泡(pH9),因此,可以通过环境pH改变控制药物释放。

2·5与聚乙酰亚胺形成复合载体

聚乙烯亚胺富含氨基,可与DNA链上负电性的磷酸根通过静电作用缔合成复合物,在此过程中,DNA会被高度压缩成50~200nm大小的纳米球,大大增强了对细胞膜的穿透作用,因此具有较高的转染效率,是目前研究较多的聚阳离子型基因载体。陈丹等[16]以天冬氨酸、谷氨酸为单体,经过聚合后作为母体骨架,将低分子聚乙酰亚胺偶合于母体上,作为DNA药物的载体,转染效率是聚乙酰亚胺的两倍,并且体外细胞毒性并没有增加。

2·6聚氨基酸作为亲水修饰材料应用

虽然PEG通常被用来作为亲水性修饰材料,但PEG修饰的过程增加了制剂的成本和产生了杂质[17-18],PEG修饰后在动物模型反复用药后表现出肾小管空泡,而且PEG的空间位阻限制了载体的细胞摄取。另外,应用PEG后在动物和人体也会产生抗体[19]。因此,研究人员尝试采用亲水性氨基酸来代替PEG。

Romberg等[20]分别用摩尔分数为5%的聚羟乙基L-天冬酰胺[poly(hydroxyethylL-asparagine,PHEA,相对分子质量3kD]、聚羟乙基L-谷氨酰胺[poly(hydroxyethylL-gluta-mine),PHEG,相对分子质量4kD]修饰脂质体,并比较其半衰期,未包裹脂质体半衰期9·7h,用聚天冬氨酸、聚谷氨酸包裹的脂质体半衰期分别为14·4h和11·9h。组织蛋白酶B、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶E都能使PHEA和PHEG降解,并且修饰后脂质体体外激活补体能力大大降低,PHEA修饰的脂质体激活程度小于PHEG修饰的脂质体。

Romberg等[21]随后验证了聚(羟乙基L-谷氨酰胺)-N-琥珀双十八烷基胺包裹脂质体,能够对以二油酸磷脂为主要组成的脂质体起稳定作用,并且由于脂质体外层包裹的聚氨基酸脱落可以控制药物释放。

Schlapschy等[22]证明通过聚氨基酸修饰HER-2抗体Fab段4D5,可以显著延长体内循环时间。4D5半衰期仅为0·5h左右,而采用甘氨酸丰富的均聚氨基酸(Gly4Ser)n100或200个重复单元修饰4D5后,其半衰期分别为2·1h和5·7h。

以上研究表明,采用亲水性氨基酸同样可以达到长循环作用,从而避免了PEG的不良反应。

3氨基酸共聚物

采用一种或几种氨基酸合成聚合物作为药物载体,其代谢产物对人体无毒,比其他高分子材料具有更高的安全性,氨基酸来源丰富,价格便宜,组成人体氨基酸有20种,可以根据需要选择,满足不同药物载体的需要,聚氨基酸分子链上具有很多活性基团(如:氨基、羧基),药物或活性物质能方便与之结合,因此聚氨基酸作为药物载体也越来越受到关注。聚氨基酸作为药物载体在应用时应该注意:

1)聚氨基酸在体内降解为氨基酸,要注意克服由此带来的不良反应,如患有苯丙酮尿症病人不宜使用含苯丙氨酸的载体;2)氨基酸在一定条件下带有电荷,选用带不同电荷的氨基酸制备药物载体要防止由于电荷吸引而导致的载体的聚集;3)氨基酸形成聚合物聚合度高时会出现溶解性问题。

韩亚冬等[23]以聚L-谷氨酸为载体材料,采用无水乳液法制备口服胰岛素微球,微球直径在5~20μm,载药质量分数为5%~9%。载药微球具有良好的pH敏感释放行为,在胃模拟液中2h释放量约为5%,在肠道模拟液中2h释放90%以上,因此,可以使胰岛素靶向于肠道释放,避免胃酸对胰岛素的破坏。

Akagi等[24]以相对分子质量为300kD的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)与L-苯丙氨酸乙酯接枝共聚,并采用水溶性碳二亚胺将卵清蛋白固化至γ-PGA纳米粒上或将卵清蛋白包裹制备纳米粒。L-苯丙氨酸乙酯与卵清蛋白疏水区域之间通过疏水作用,该载体37℃,pH7·4条件下10d的释放量不超过5%。体外细胞毒性试验结果表明,该纳米粒对HL-60细胞无任何毒性,具有生物降解性和生物相容性,能调节分布和细胞特异性传递,有望作为蛋白类药物载体。Kima等[25]以L-谷氨酸γ-苄酯与L-苯丙氨酸合成嵌段供聚物,经脱去苄酯后形成两亲性共聚物制备泡囊,有望作为药物载体。

Du等[26]证实同服聚天冬氨酸可以提高细胞内氨基糖苷类药物浓度并且降低毒性。在给予庆大霉素的同时给予聚天冬氨酸,细胞内庆大霉素浓度是单独使用庆大霉素的1·2~1·3倍。

4结语

聚氨基酸生物相容性好、容易被机体吸收、体内降解为氨基酸对人体无毒副作用,最为突出的是具有很多药物或活性物质能与之共价键结合的功能团,聚氨基酸的研究已相当深入和广泛。目前合成聚氨基酸多是采用氨基酸与三光气作用形成氨基酸环内酸酐,采用伯氨基引发开环形成新的伯氨基酸再引发其他氨基酸环内酸酐的开环,如此循环,形成聚合物,但要工业化合成均一、质量稳定的聚氨基酸尚待研究。2008年日本窒素公司和福井县立大学宣布发现了均聚氨基酸合成酶[27],这一发现给生物合成聚氨基酸提供了基础。聚氨基酸在给药系统中的应用已成为药剂学研究热点,并且正在进行临床试验,相信很快能得到广泛应用。

聚氨基酸载体研究进展责任编辑:陈老师    阅读:人次