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法医体液溯源分子生物学技术研究

2019/07/02 阅读:

【摘要】通过对犯罪现场发现的体液溯源,可以在样本来源者与实际犯罪行为之间建立联系,为现场重建提供重要证据。随着分子生物学技术的发展,DNA甲基化、RNA等遗传标记以及特定微生物检测被发现具有潜在的法医体液溯源价值。本文对近年来应用分子生物学方法进行法医体液溯源的研究现状和应用前景进行综述。

【关键词】法医物证学;体液鉴别;DNA甲基化;RNAs;法医微生物

体液斑痕,如血痕、精斑、唾液斑等,是犯罪现场最常见的生物物证检材。明确生物斑痕的组织/体液来源,能够为确定案件性质、进行犯罪现场重建提供重要证据。传统的体液识别主要应用血清学和免疫学方法,检测体液斑中特定的蛋白质分子标记,检材消耗量大,灵敏度和特异性各异,且通常一次实验仅能分析一种体液。物理学方法如交替光源法、拉曼光谱法等,对检材无损耗,但方法的可重复性、识别多个样本及混合样本的能力还有待考量。近年来,基于DNA甲基化水平、不同类型RNA表达水平差异以及特定微生物分析进行体液识别的分子生物学技术得到广泛的关注。

1DNA

甲基化差异在体液溯源中应用潜能DNA甲基化是细胞控制基因表达的表观遗传机制之一。提取的DNA中,甲基化可被保留。全基因组DNA甲基化分析表明,哺乳动物基因组中存在很多组织特异性差异甲基化区域(tissuespecificdifferentiallymethylatedregions,TDMR)[1],这使DNA甲基化成为潜在的组织/体液鉴别分子标记。2011年Dan等[2]报道了15个在血液(静脉血/月经血)、唾液、精液、皮肤上皮、尿液及阴道分泌物间表现出差异甲基化的基因位点。2014年,Park等[3]应用芯片筛选出2986个候选区域,从中挑选了8个甲基化位点(血液:cg06379435和cg08792630;唾液:cg26107890和cg20691722;精液:cg23521140和cg17610929;阴道分泌物:cg01774894和cg14991487)应用焦磷酸测序方法进行评估,所有位点在体液鉴别中均表现出高特异性及高灵敏度。2015年,Lee等[4]同样应用芯片筛选出与Park等[3]的研究不完全相同的64个CpG位点,同时建立了基于SNaPshot方法的包含8个位点的复合检测体系,可以区分血液、唾液、精液和阴道分泌物;随后的研究又加入了位于SLC26A10基因启动子区的两个月经血特异性甲基化位点cg09696411和cg18069290[5]。DNA甲基化检测可以与法医常用的以DNA为基础的实验方法(如DNA提取,PCR法及DNA分型)相兼容,与传统方法相比,具有较高的特异性及灵敏度。DNA较RNA更稳定,更适于对高度降解检材或陈旧检材进行体液溯源。但甲基化水平易受年龄、疾病等因素影响,筛选更多的DNA甲基化标记及对已有标记的验证还需要进一步探究。

2体液特异

mRNA是目前最成熟分子标志物应用信使RNA(messengerRNA,mRNA)进行组织/体液溯源较甲基化研究开展得更早。目前已有不同实验室报道了多个用于法医相关体液识别的mRNA,其中五种常见体液的特异性mRNA总结如表1[6-8]。欧洲DNA分型工作组(theEruopeanDNAprofilinggroup,EDNAP)针对基于毛细管电泳技术的mRNA检测方法和DNA/RNA共提取技术已进行数次合作研究。最近,已有研究者将二代测序技术应用于组织/体液特异性mRNA检测。Zubakov等[9]建立了一种基于IonTorrentPGM平台的检测方法,能同时分型9种常染色体STR、牙釉蛋白基因及12种mRNA,在个体识别的同时实现样本组织/体液类型鉴别。Hanson等[10]构建了包含33种mRNA的二代测序方法,用于鉴别6种法医常见组织/体液,通过偏最小二乘法和线性判别式法分析该体系的测序数据,实现对样本来源的预测分类[11]。同时,欧洲法医遗传学合作网络(EuropeanForensicGeneticsNetworkofExcellence,EUROFORGEN-NoE)联合EDNAP针对该体系进行了实验室评估[12]。mRNA的稳定性制约着其在法医检案中的普遍应用。强紫外光、高温、潮湿,尤其是环境中无处不在的核糖核酸酶等因素都会使mRNA很快降解。但也有研究报道某些体液特异性mRNA在保存几年[6]甚至几十年[13]的陈旧样本中依旧能被检测到,这大大增加了mRNA在法医实践中的应用价值。

3新兴非编码

RNA可成为转录水平体液鉴别候选标记非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)是指相对于具有翻译功能的mRNA而言,不编码蛋白质的一类RNA。近年来不同种类的ncRNA逐渐被发现并得到研究。某些ncRNA在不同类型的组织细胞中具有特异性表达的特征。在法医领域较受关注的主要有微小RNA(microRNA/miRNA)和环状RNA(circularRNA,circRNA)。3.1miRNAmiRNA是一类小的ncRNA,长度为18-25nt,参与转录后基因表达调控。与mRNA相比,miRNA片段短小,相对稳定。迄今为止,miRNA数据库已收录28589条miRNA。miRNA在不同组织中具有特异性的表达谱,可成为法医体液鉴别的候选遗传标记。2009年,Hanson等[14]首次评估了miRNA在不同体液斑中的表达谱,并筛选出9种miRNA(miR451、miR16、miR135b、miR10b、miR658、miR205、miR124a、miR372、miR412)用以区分血液、精液、唾液、阴道分泌物和月经血。2010年,Zubakov等[15]利用基因芯片技术检测718种miRNA在五种常见体液中的表达情况,发现了4种血液特异性miRNA(miR-20a、miR-106a、miR-185、miR-144)和5种精液特异性miRNA(miR-135a、miR-10a、miR-507、miR-943、miR-891a);同时,其对Hanson等报道的候选miRNA进行验证的结果显示,除血液和精液外,其余体液特异性miRNA均不能被重复。Wang等[16]应用TaqMan®ArrayHumanMicroRNACards检测了754种已知人类miRNA在不同体液中的表达水平,最终筛选出miR16(血液),miR486、miR888(精液)和miR891a、miR214(月经血)分别作为以上三种体液的分子标记。2016年该课题组利用IonPGMTMSystem平台分析了miRBasev21数据库中的2588种成熟miRNA在血液及唾液样本中的表达及分布情况,并筛选出6种血液特异性miRNA和19种唾液特异性miRNA[17]。miRNA的表达水平易受疾病[18]等因素影响,联合应用多种miRNA能提高鉴别的精准度。另外,不同实验室即使应用相同的技术进行miRNA位点的筛选及验证,结果也不尽相同,这可能与检测方法和对结果的评价标准不同有关。3.2circRNAcircRNA是一类新型的ncRNA,是RNA经过反向剪接形成的单链共价闭合环状分子,无5'末端帽子及3'末端poly(A)尾巴结构。迄今为止,研究人员已经发现circRNA在多种组织和体液(如睾丸(15996种)[19],唾液(约400种)[20]等)中种类丰富。值得注意的是RNaseR、RNaseⅡ、多核苷酸磷酸化酶、寡核糖核酸酶等常见核酸酶均不能有效水解circRNA。由于circRNA相对稳定,临床上多被用来研究作为疾病诊断的分子标志物。circRNA同样具有组织特异性。2016年Xia等[21]筛选出人和鼠基因中302853种组织特异性circRNA。Dong等[19]利用高通量测序筛选出60种circRNA,经qRT-PCR验证后发现了10种睾丸特异性circRNA,其来源基因为LRWD1、STK31、HIST1H2BA、RNF17、BRDT、SMC1B和SPATA16。Bahn[20]等利用二代测序技术对唾液中细胞外circRNA进行研究,发现circRNA具有细胞外功能并可能作为唾液的一类分子标志物。基于以上特点,circRNA可能成为法医组织/体液鉴别新兴的候选标记。近几年已有研究者在法医学领域对circRNA进行相关探索。Song等[22]利用芯片技术检测了五种法医相关体液中的circRNA,发现精液、唾液和静脉血的表达谱相对特异,而月经血与阴道分泌物表现出相似的特征。Zhang等[23]检测了外周血和月经血(取自月经周期1-3天)中来源基因为ALAS2和MMP7的mRNA及circRNA,发现在分型mRNA的同时检测相同基因来源的circRNA,可提高检测的灵敏度及稳定性。本实验室近期已通过二代测序及qRT-PCR方法筛选出4种仅在月经血中表达的circRNA,可用于法医外周血与月经血鉴别。

4人体微生物群落分布有助区分特定体液

人体不同部位有不同的微生物群落,而某些微生物只存在于特定体液中。Giampaoli等[24]的研究表明,女性生殖道细菌、链球菌和肠球菌分别在阴道、口腔和粪便中显示出特异性信号。Zou等[25]分析了中国汉族人群中以上三种检材的微生物菌群特征,认为詹氏乳杆菌、卷曲乳杆菌及单行拟杆菌、多型类杆菌可有效区分阴道液和粪便。离体检材中微生物的种类和数量会因其本身的生长和降解、环境中微生物的滋生而发生变化,同时疾病的发生、抗生素的使用也会影响体内微生物的菌群特征,应用微生物群落分布规律进行体液推断还需结合多方因素综合分析。

5总结与展望

对遗留在犯罪现场的体液来源进行鉴别有助于还原案件事实,在法医实践中具有重要意义。应用分子生物学技术,能够实现在一次检测中分析多种体液特异性遗传标记,避免浪费有限的现场检材。但无论是DNA甲基化、转录水平遗传标记还是特定微生物菌群的检测结果,均易受年龄、疾病、环境等因素影响,需要多手段、多维度联合解读。随着相关研究的逐步深入,新的特异性标志物被不断发现,检测技术及分析理论日趋完善,未来有望建立统一规范的体液溯源法医实验室检测流程和判定标准,以科学客观的鉴定结论协助刻画犯罪行为过程,充分发挥生物物证在司法审判中的作用。

作者:石珂 李淑瑾 付丽红 张晓静 付光平 王茜 丛斌 单位:河北医科大学法医学院

法医体液溯源分子生物学技术研究

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