细菌素生物学论文范文

1实验方法

1.1指示菌的筛选唾液乳杆菌LH1F的新鲜菌液以2%接种量接种于10mLMRS液体培养基中，37℃培养24h，发酵液4℃下7000r/min离心20min，得发酵上清液。采用单层琼脂平板打孔法检测其抑菌活性：制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌CMCC44102、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115三种常见指示菌菌悬液（浓度为106CFU/mL），在无菌平皿中加入指示菌菌悬液1mL，倒入约20mL营养琼脂培养基，混合均匀，待培养基凝固后，用直径8mm打孔器均匀打孔，向孔内加入发酵上清液0.1mL，于4°C冰箱中扩散过夜后，37℃培养12h，测量抑菌圈的直径（mm）。

1.2菌体细胞、有机酸及过氧化氢的排除实验将唾液乳杆菌LH1F的发酵上清液用微孔滤膜（孔径为0.22μm）的细菌滤器过滤去除菌体细胞；将无菌体发酵上清液用1mol/L的NaOH溶液中和至pH5.0；将无菌体发酵上清液经过氧化氢酶处理（酶浓度为10mg/mL，pH7.0，37℃水浴1h），将上述处理的样品及唾液乳杆菌LH1F原发酵上清液、pH5.0的乳酸分别做抑菌实验[8]，比较不同处理抑菌活性的差异。

1.3蛋白酶的敏感性将经胰蛋白酶（酶浓度为10mg/mL，pH7.0，37℃水浴2h）、胃蛋白酶（酶浓度为10mg/mL，pH3.0，37℃水浴2h）处理后的无菌体发酵上清液以及未经蛋白酶处理的无菌体发酵上清液检测其抑菌活性的差异。

1.4唾液乳杆菌LH1F生理曲线测定唾液乳杆菌LH1F新鲜菌液以2%的接种量接种于150mLMRS培养基中，每隔2h（0~36h）取1mL发酵液置于离心管中，以MRS培养基作为空白对照，测量OD600nm值和pH，用各个培养时间的发酵上清液做抑菌实验，测量抑菌圈的直径。

1.5唾液乳杆菌LH1F产细菌素的初步纯化向无菌体发酵上清液分别经30%，40%，50%，60%，70%，80%饱和度硫酸铵沉淀，4℃静置过夜，4℃、7000r/min离心30min，收集沉淀，将沉淀重悬于原体积1/10的pH5.0，0.1mol/L的柠檬酸酸盐缓冲液中，检测盐析上清液与沉淀复溶液的抑菌活性。将抑菌活性最高的沉淀复溶液经截留分子质量3ku的超滤离心管超滤[9]（5000×g，4℃）得浓缩液（M>3ku）及超滤液（M<3ku），分别取原液、浓缩液及超滤液测定抑菌活性。

1.6唾液乳杆菌LH1F产细菌素的生物学特性

1.6.1热稳定性细菌素粗提液样品分别于60℃、80℃、100℃、121℃条件下热处理30min（121℃处理样品置于烘箱，其余温度置于电热恒温水槽），冰浴冷却后，以未经热处理的样品为对照，进行抑菌实验，比较抑菌活性的变化情况，确定该细菌素的温度稳定性。

1.6.2pH稳定性分别取0.5mL的细菌素粗提样品于离心管中，用1mol/LHCl和1mol/LNaOH分别调pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，37℃水浴2h后，调pH至5.0，以MRS培养基用1mol/LHCl和1mol/LNaOH调至相应pH作为对照，做抑菌试验检测抑菌活性的变化。

1.6.3蛋白酶敏感性细菌素粗提样品用1mol/LHCl和1mol/LNaOH分别调至各酶的最适pH（胃蛋白酶pH调至3.0，胰蛋白酶、蛋白酶KpH调至7.0），加入酶的终浓度为10mg/ml，以同比稀释的细菌素粗提样品作为对照，37℃水浴2h，然后将pH调回至初始的pH，以未加入酶的发酵上清液作对照，分析该细菌素粗提样品以不同蛋白酶处理后抑菌活性的变化。

1.6.4抑菌谱选取金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、鸡大肠杆菌O-78、大肠杆菌CMCC44102、鸡白痢沙门氏菌C-79、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115、黑曲霉、根霉、青霉、啤酒酵母、红酵母11株菌为指示菌，采用单层琼脂平板打孔法分别对供试的菌株做抑菌试验，测试细菌素粗提样品的抑菌活性。

2结果与分析

2.1指示菌的筛选通过单层琼脂平板打孔法检测到唾液乳杆菌LH1F的发酵上清液对三种常见病原指示菌均有一定的抑菌性，结果见表1，金黄色葡萄球菌作为指示菌培养12h的抑菌效果最为明显，但与大肠杆菌CMCC44102及鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115的抑菌效果差异不明显，因此以下抑菌实验革兰氏阳性菌采用金黄色葡萄球菌，革兰氏阴性菌采用大肠杆菌CMCC44102作为指示菌，培养观察时间为12h。

2.2抑菌物质性质的确定不同处理对唾液乳杆菌LH1F发酵上清液抑菌活性的影响结果如图1所示：去除菌体细胞后，该发酵上清液的抑菌作用与原发酵上清液差别不大，说明发酵上清液中的抑菌性不是菌体细胞作用的结果；排酸作用后，该发酵上清液抑菌活性降低，但仍有一定的抑菌作用，而相同pH值的乳酸无抑菌活性，说明发酵上清液中还有其他抑菌物质存在；发酵上清液经过氧化氢酶37℃水浴1h处理后，抑菌活性比处理前的原发酵上清液小，但仍保留了较强的抑菌作用，说明发酵上清液中过氧化氢不是主要的抑菌物质，还有其他的抑菌物质存在。发酵上清液经过胃蛋白酶处理后，抑菌活性下降22.22%，发酵上清液经过胰蛋白酶处理后，抑菌活性下降了19.44%，抑菌物质对蛋白酶较敏感，说明抑菌物质为蛋白质类物质，初步确定为肽类细菌素。

2.3唾液乳杆菌LH1F生理曲线的测定将唾液乳杆菌LH1F的新鲜种子液按2%的体积比接种于MRS培养基中，37℃培养后每隔2h取样，测定OD600nm值，pH和上清液的抑菌活性，该菌株的生理曲线（0~36h）的测定结果如图2，菌株置于37℃培养，2~6h即进入对数生长期，12h左右进入稳定期。发酵上清液的pH在发酵2h后开始发生变化，2~8hpH迅速下降，从4.8降至3.5，8~20hpH缓慢下降，从3.5降至3.0，12h后恒定在pH3.0。在对数期生长前期（4h）开始产生细菌素，进入对数生长期（4~12h）后细菌素产量持续增加，培养16h的细菌素产量达到最大值，此时抑菌活性达到最高，随后保持稳定，整个过程受pH的影响较小，结果表明唾液乳杆菌LH1F在对数生长前期就产生细菌素。

2.4唾液乳杆菌LH1F细菌素的初步纯化硫酸铵沉淀后，分别用盐析上清液和沉淀复溶液作抑菌试验，结果如图3所示，硫酸铵饱和度为30%及40%时盐析所得的上清液均有抑菌效果，30%饱和度的抑菌效果比40%的好，而且30%饱和度盐析所得的上清液抑菌效果比沉淀复溶液要好，说明30%饱和度硫酸铵不能较好地沉淀唾液乳杆菌LH1F所产的细菌素。随着硫酸铵盐饱和度的增大，沉淀复溶液抑菌效果增强并在60%时达到最佳，70%，80%饱和度时沉淀复溶液抑菌效果有所下降。因此，可以进一步确定抑菌物质主要为蛋白质类物质，盐析的硫酸铵饱和度为60%时效果最佳。将所得的沉淀复溶液经截留分子量为3ku的超滤离心管超滤后，取原液、浓缩液及超滤液分别测定其抑菌活性。结果显示，浓缩液的抑菌活性比原液（粗提液）强，而超滤液仅具有微弱的抑菌圈，表明绝大部分细菌素能被3ku截留分子量的超滤管截留。

2.5唾液乳杆菌LH1F产细菌素的特性研究

2.5.1热稳定性唾液乳杆菌LH1F所产细菌素在不同的温度下进行处理，检测抑菌活性，热稳定性实验结果表明(图4)，随着温度的升高，细菌素的残余活性有所降低，但抑菌活性变化不是很大，样品经60~80℃处理30min，抑菌活性保留95.9~91.8%之间；经100℃处理30min后，抑菌活性保留87.8%，而经121℃处理30min后，其抑菌活性仍保留在75.5%，该细菌素表现出良好的热稳定性，与文献报道[7]的唾液乳杆素均属于第Ⅱ类细菌素（分子量小于10ku的小分子热稳定肽）相符。食品加工中常用的巴氏杀菌条件为65~80℃15min，而此细菌素在巴氏杀菌的条件下仍保持90%以上的高活性，显示出其在食品加工中的广泛应用前景。

2.5.2pH稳定性pH稳定性实验结果表明(表2)，唾液乳杆菌LH1F所产细菌素在偏酸的环境中有较强的抑菌性，活性pH范围为2.0~5.0，pH越低，活性越强，pH为2.0时抑菌活性最强，当pH>6.0时，细菌素基本没有抑菌性，说明所产细菌素在酸性条件下有较好的稳定性,，而在中性或碱性条件下即会失活。

2.5.3对蛋白酶的敏感性唾液乳杆菌LH1F所产细菌素样品分别经不同的酶在37℃条件下处理2h，检测抑菌活性，以确定该细菌素的蛋白酶敏感性。结果表明（图5），样品产生的细菌素对蛋白酶敏感，经胃蛋白酶处理后抑菌活性下降约35%，经胰蛋白酶处理后抑菌活性下降约30%，经蛋白酶K处理后抑菌活性下降约21%，说明该抑菌物质是蛋白类物质，可被蛋白酶降解而不会在体内残留，作为食品防腐剂使用安全性相对较高。

2.5.4抑菌谱的测定用粗提样品分别对供试的G+菌株、G-及部分真菌做抑菌实验，结果表明（表3），唾液乳杆菌LH1F所产细菌索不仅对供试的1株金黄色葡萄球菌、1株苏云金芽孢杆菌等革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，对2株大肠杆菌、2株沙门氏菌等革兰氏阴性菌也有较强的抑制作用，但是对酵母菌及曲霉、青霉、根霉等霉菌未见有抑制作用。该细菌索有较宽的抑菌谱，不仅对芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有明显抑制作用，同时对大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌也表现抑菌活性，可广泛用于食品的防腐杀菌处理。

3结论

乳酸菌在代谢过程中除细菌素外，还能产生乙酸、乳酸及过氧化氢等具有抑菌活性的物质。唾液乳杆菌LH1F分离自从猪肠道内容物，其发酵上清液在排除菌体细胞、有机酸、过氧化氢干扰后，仍然保留较强的抑菌活性，经胰蛋白酶、胃蛋自酶处理后，抑菌活性降低，表明抑菌成分为细菌素。发酵上清液经60%硫酸按盐析及超滤初步纯化，特性实验研究结果显示：唾液乳杆菌LH1F产生的细菌素具有良好的热稳定性，随着温度的升高，细菌素的残余活性有所降低，但抑菌活性变化不是很大，121℃处理30min仍有保持75.5%的抑菌活性；在酸性环境下稳定，作用效果也较好，在中性或碱性条件下抑菌活性减弱或丧失，pH的活性范围是pH2.0~5.0；对胃蛋白酶较为敏感，抑菌活性下降约35%，经胰蛋白酶处理后抑菌活性下降约30%，经蛋白酶K处理后抑菌活性下降约21%；唾液乳杆菌LH1F在对数生长前期就会产生细菌素，进入对数生长期后细菌素产量持续增加，整个过程受pH的影响较小；该细菌素具有较广的抑菌谱，对供试的金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌等多种革兰氏阳性菌及大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌抑制作用明显，但对酵母菌及常见霉菌未见有抑制作用，具有作为食品生物防腐剂的潜在应用价值。该细菌素与上述报道的Ⅱb类唾液乳杆素具有一些共同特征，但是该细菌素是否一种新的Ⅱb类唾液乳杆素，还有待进一步的研究。

作者：李雪玲邓绮敏罗少雯许瑞美罗奕慧胡文锋单位：华南农业大学食品学院