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法医学溺死诊断中硅藻检验方法的应用

2019/09/08 阅读:

摘要:水中尸体的死因判断一直是法医学实践中的热点问题,而硅藻检验被认为是一种相对可靠的诊断溺死的方法。本文通过对国内外法医硅藻研究进展相关文献报道进行总结,综述了硅藻检验在法医溺死诊断中的应用,包括法医学硅藻检验的发展历史、意义及常用检验方法,即消化法、化学元素法、DNA分子生物学检验方法,通过对检验方法优、缺点的探讨,对硅藻检验中存在的问题、发展方向进行了讨论分析,以期待对溺死鉴定有所帮助和借鉴。

键词:硅藻;溺死;分子生物学;DNA检验;扫描电镜

硅藻检验被公认是一种可靠的检验方法,可为水中尸体死因诊断、入水地点及死亡方式判断提供强有力依据。笔者长期工作于公安一线,本文从刑事侦查及法医学的角度,综述硅藻检验在法医学溺死诊断中的发展与应用,供同行借鉴。

1硅藻检验在法医学溺死诊断实践中的意义

1.1硅藻的生物学特性

硅藻是一种单细胞植物,其生物学特性,使其具有两大特点:一是硅壳使硅藻不易受外界环境影响,可有效保存遗传物质;二是硅藻外壳纹路具有特异性,便于区分种属。

1.2硅藻的法医学检验史

19世纪末,人们开始对溺死尸体进行硅藻检验。1904年,Revenstorf发现了水中的浮游生物可以通过溺液进入肺脏。1937年Kasparek消化法奠定了基础。1951年,Weinig和Pfanz创立单溴苯染色硅藻检验法。1950年起,Auer等[1]开始硅藻检验的定性、定量研究。硅藻检验的法医学价值得到全球多个地区专家的认可,在溺死诊断中占有不可忽视的地位。

1.3硅藻检验的法医学原理及意义

1.3.1死亡原因的推断生前溺死者在溺死过程中因主动呼吸,硅藻随溺液进入肺泡,并穿透毛细血管壁进入体循环,到达全身各器官,甚至骨髓。而死后抛尸入水者,因缺乏上述呼吸循环运动,硅藻有可能进入呼吸道甚至肺,但无法进入体循环。通过溺死和非溺死者体内硅藻量的研究统计,二者有着明显差异[2]。2018年,刘泉等[3]对100例大鼠溺死与死后入水进行对比,认为心、脾内的硅藻含量均与水中硅藻浓度成正比,更适用于溺死诊断检验。

1.3.2落水位置的推断硅藻的生长繁殖与环境中光照、温度、水体成分、水流速度、环境pH值等因素息息相关,因此不同水域中的硅藻种类和含量有很大差异。Ludes[4]利用尸体中硅藻进行落水点推断的研究,取得了成果,对案件性质的推断有着重要意义。

2硅藻检验方法

目前硅藻检验方法大致可以分为三类:消化法、化学元素法、DNA分子生物学检验法[5]。

2.1消化法

2.1.1无机消化法最初的硅藻检验方法有焚烧法、浸渍法、硅胶梯度离心法等[6],主要通过简单的焚烧或浸泡的方式检测硅藻。1937年Kasparek创立浓硝酸法[7],奠定了传统无机消化法的基础。此后,无机消化法进行了多次技术革新,从硝酸乙醇法[8]、硝酸乙醚法[9],到浓硫酸浓硝酸过氧化氢法[10],可以归纳为强酸加热法,主要是在酸的种类、催化剂等方面进行改良,该类方法使硅藻检出率大大提高,但存在一定危险性,对环境污染较大,因此该类方法已经逐渐被替代。在上述强酸消化的基础上,1988年李延阁研制出“破机罐”法[11]使硅藻检验技术进入仪器设备化新篇章。此后出现了以微波加热+压力可控密闭消解罐为原理的微波消解仪[12],并以此为基础设计了微波消解+扫描电镜联用法[13],该方法使用了微波消解法和滤膜富集技术,使有机物消解更彻底,有效提高了硅藻的检出率,是目前被广泛使用的硅藻检验方法,但该法检验成本较高,检验周期长,且对技术人员的能力要求高,因此不易在基层推广应用,因此,王玉仲等[14]对滤膜进行透明化处理,可在普通光学显微镜下观察硅藻,有效降低了检验成本。

2.1.2有机消化法相对于无机消化法,有机消化法更加温和,对硅藻破坏度低,能有效保留其核酸物质,便于后续分子生物学检测,但其消化能力有待进一步提高。有机消化法主要有Soluene-350消化法[15]及酶消化法[16]两种。Soluene-350是一种含有四个铵离子的羟化物,其消化能力与强酸相当,但海水中的一些硅藻容易被Soluene-350消化,因此此法仅适用于淡水硅藻检验。此外,在Soluene-350消化法基础上增加超声波加热程序可缩短试验时间。利用蛋白酶K和SDS(十二烷基磺酸钠)消化组织的方法称为酶消化法,这一方法既可以检测出硅藻,又可以检出其他浮游生物,并且有效避免了强酸对硅藻的破坏。

2.2化学元素法

该方法主要通过紫外光激发水中浮游生物(包括硅藻)叶绿素a产生荧光,从而测算各器官中浮游生物含量,判断水中尸体是否为溺死。此种检验方法操作简单,污染小,成本低。但考虑到人体组织中其他荧光物质会随着尸体在水中浸泡的时间延长而增多,因此存在检测结果假阳性率高的风险。2.3分子生物学检验方法2.3.116SrDNA、18SrDNA和SSU基因的检验1996年Kane等[17]通过PCR法从已知溺死尸体的组织中扩增出蓝藻16SrDNA,以此证明蓝藻可随体循环进入各器官中。2008年何方刚等[18]利用Nubel设计的特异性引物,扩增了三个不同水域的DNA、两种水域中溺死的实验动物肺组织DNA,发现溺死动物肺组织基因片段与该水域组的特异性基因片段存在相关性,与无关水域组的基因片段存在差别,从而表明通过PCR-DGGE检测法检测16SrDNA可以为判断溺死点提供依据。2017年,Zhao等[19]通过对18SrDNA的V7区域进行焦磷酸测序(PSQ),确定不同硅藻的相应分类群,进一步为推断溺水位点提供依据。2013年,余政梁等[20]进行了动物实验,通过检测硅藻SSU片段,发现在溺死组动物组织中硅藻阳性检出率远远高于非溺死组,认为该方法可以为溺死诊断提供有效依据。PCR-DHPLC法检验硅藻种类相对于消化法(如强酸-微波法)检出率更高,降低了样本的需求量。2.3.2叶绿素相关基因检验1)植物叶绿体1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基(ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase,rbcL)基因检验rbcL基因是植物叶绿体进行光合作用的关键基因片段,广泛应用于植物和藻类的分类研究。2012年,Kathleen等[21]设计针对硅藻rbcL基因特异性引物,用PCR-DHPLC法成功检出各类较少见的硅藻种属。2018年,彭帆等人[22]检测了21种标准藻株、3种人体共生标准菌株和人类DNA片段,验证引物特异性和灵敏性,同时与电镜下硅藻检验做了对比,结果证明,基于rbcL引物建立的PCR检测法能快速检测硅藻rbcL基因,所需检材量少。可见,检测硅藻rbcL基因的方法,在溺死的推断中应用前景良好。2)纤细裸藻和肋骨条藻相关基因检验纤细裸藻(EuglenagracilisKlebs,EG)和肋骨条藻(SkeletonemaCostatum,SK)在各类水域十分常见,EG1、EG2、和SK1、SK2是叶绿素相关基因的表达产物,不存在于人体组织。2003年,Suto等[23]在溺死动物的肺、肝、肾中均检出上述4种基因特异性DNA片段,为硅藻检验提供新方向。2008年,李小廷等[24]针对编码EG1、EG2、和SK1、SK2相关基因,检测溺死动物组织中的硅藻DNA,同时对比硝酸消化法检测硅藻,结果证明通过检测EG基因的方法检出率要高于硝酸消化法,具有统计学意义。

3存在的问题及展望

3.1硅藻种属的判断

消化法联合形态学观察判断硅藻种类准确度高,但消化法常对准确判断存在诸多干扰,如无机消化法有可能会破坏硅藻形态,有机消化法有可能由于消化不完全掩藏硅藻形态,并最终导致部分硅藻种类遗漏。分子生物学检验方法中目的DNA片段较单一,灵敏度高,但较难提供准确硅藻种属结果。如能寻找到特异性更高的基因片段,并建立更加全面的硅藻基因库,则可为硅藻种属判断提供有效平台。

3.2硅藻的定量

在实际硅藻检验中,各器官中的硅藻定量对于判断死因是否为溺死至关重要,但目前的各种检验方式均存在不同的困难。以消化法中应用较为普遍的强酸微波消解电镜法为例,无机消化法对硅藻破坏严重,硅藻碎片常难以准确计数,且肉眼观察计数存在无法避免的误差,因此无法精确统计硅藻数量。而有机消化法常存在消化不完全的问题,导致部分硅藻计数的遗漏。如何在保证硅藻形态完整性的同时建立自动扫描计数机制有可能成为硅藻检验的下一步研究方向。分子生物学检验方法的定量统计存在的问题主要是操作过程中样本的损耗。

3.3硅藻的DNA检验方法

分子生物学检验方法仍有较大发展空间:首先,硅藻DNA检验片段较为单一,且硅藻DNA目前大多停留在共性DNA的检测水平上,缺乏种属特异性的检测,下一步可以探索和研究硅藻种属特异性的检验方法,同时综合使用其他溺死相关浮游生物的特异性引物进行探索,使所检测浮游生物种类更丰富,结果更精确,为溺死诊断提供可靠证据。其次,溺死尸体多为腐败尸体,DNA可能存在降解,改良硅藻DNA提取、纯化方法,提高DNA检出率亦是未来发展的方向之一。综上,硅藻检验的意义毋庸置疑,虽然目前该应用方法普遍存在成本高、对技术人员要求高、检验时间长、检验方法不成熟、环境污染等问题,但其已成为一种重要的技术方法,可为侦查办案提供线索和证据,下一步还应尽快完善该检验技术方法的行业标准,指导公安实战。

参考文献

[3]刘泉,陈轶群,柯技,等,生前溺死与死后入水SD大鼠心脏与脾脏内硅藻检验的研究[J].系统医学,2018(11):13-17.

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[7]王会品.勒福特王水消解法检验硅藻的法医学应用研究[D].广州:南方医科大学,2014.

[8]王磊,王杰,王恩寿,等.非溺死尸体肺脏硅藻最大值在溺死鉴定中的应用初探[J].中国法医学杂志,1998,13(3):134-136.

[9]郭景元.现代法医学[M].北京:科学出版社,2000:388-390.

[11]李延阁,胡传英.法医用硅藻检查破机罐的研制[J].实验室研究与探索,1998(6):94-95.

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[13]胡孙林,温锦锋,张小婷,等.微波消解-扫描电镜联用检测脏器内硅藻[J].中国法医学杂志,2010,25(3):145-149.

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[18]何方刚,黄代新,刘良,等.PCR-DGGE法检测浮游生物16SrDNA在溺死鉴定中的应用[J].中国法医学杂志,2008(4):234-237.

[20]余政梁,刘超,胡孙林,等.PCR-DHPLC法检测硅藻SSU基因在溺死鉴定中的应用[J].中国法医学杂志,2013(6):457-460.

[22]彭帆,刘超,徐曲毅,等.溺死相关硅藻rbcL基因检测技术研究[J].重庆医科大学学报,2018,43(1):98-102.

[24]李小廷,黄代新,林宇新,等.检测浮游生物叶绿素相关基因诊断溺死的实验研究[J].中国法医学杂志,2008(3):151-156.

作者:刘萌妍 赵伟 赵怡 单位:北京市公安司法鉴定中心

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