Ames试验的继承毒理学研究范文

作者：田逸君张天宝朱玉平马玺里毕洁郑怡文单位：中国人民解放军第二军医大学卫生毒理学教研室上海

降纤酶（defibrase）已在临床广泛应用，如去纤、抗凝、调脂、扩张血管和改善微循环等，但作为异源蛋白，其在使用中不可避免地具有蛋白质类药物的共同缺点，如具免疫原性、半衰期短、稳定性差等。聚乙二醇修饰技术是近年来发展的用于改进蛋白质类药物体内药动学性质的新技术，它将单甲氧基聚乙二醇分子键合到蛋白质分子表面，改变蛋白质的空间结构，进而改变其生化性质。此法可有效降低蛋白质的免疫原性，延长半衰期，减少给药次数。本实验的受试物是一种供注射用的含有聚乙二醇修饰降纤酶的药物组合物。为评价其是否具有遗传毒性，本研究应用鼠伤寒沙门菌回复突变试验（亦称Ames试验）、体外培养中国仓鼠卵巢（CHO）细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验方法进行了检测，目的是为聚乙二醇修饰降纤酶的临床前毒性评价提供资料。实验材料与动物受试物：聚乙二醇修饰降纤酶（纯度：98．9％，含量：200U•mL－1，批号：20070501），由上海医药工业研究院生物制药部提供，无色澄明液体。菌株：组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌（S．typhimurium）TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株，由复旦大学公共卫生学院环境卫生学教研室赠予，贮存于液氮中。实验前进行菌株鉴定（R因子鉴定、自发回变数鉴定），均符合规定标准。S9代谢活化系统是从经过酶诱导剂处理的啮齿类动物的肝脏所提取的带有辅助因子和微粒体部分，购于美国MOLTOX公司。CHO细胞由复旦大学公共卫生学院毒理教研室赠予。ICR小鼠（SPF级）共50只，每组10只，雌雄各半，7～8wk龄，体重19～21g，由上海西普尔－必凯实验动物有限公司提供，实验动物质量合格证号：0047004。

实验方法与分组按《药物遗传毒性研究技术指导原则》及《ICH药品注册的国际技术要求（安全性部分）》的相关要求，应用Ames试验[6]、体外培养CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验[8]检测聚乙二醇修饰降纤酶的遗传毒性，分别从DNA损伤、基因突变和染色体畸变3个方面进行遗传毒性评价。

Ames试验：采用标准平板掺入法，使细菌在加或不加代谢活化系统（±S9）条件下接触受试物，5个菌株（TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535）均设100、20、4、0．8、0．16U5个剂量组，每培养皿均加入相应浓度的受试物溶液0．1mL，此外设空白对照、溶剂对照和阳性对照，每个剂量组及对照组均设3个平行皿。＋S9阳性对照：TA97、TA98及TA100为2－氨基芴（每皿10μg），TA102为1，8－二羟基蒽醌（每皿50μg），TA1535为环磷酰胺（每皿50μg）；－S9阳性对照：TA97和TA98为对二甲基氨基苯重氮磺酸钠（每皿50μg），TA100和TA102为甲基磺酸甲酯（每皿1μg），TA1535为4－硝基喹啉－N－氧化物（每皿0．5μg）；溶剂：0．85％NaCl溶液。

体外培养CHO细胞染色体畸变试验：使细胞在加或不加代谢活化系统（±S9）条件下接触受试物，高剂量组为委托单位提供的受试物原液可以达到的最高浓度10U•mL－1，再分别以5．0、2．5U•mL－1作为中、低剂量，共设3个剂量组；试验时在10mL的试验体系中分别加入各浓度应用液500μL，另设阳性对照和溶剂对照。＋S9阳性对照：环磷酰胺60mg•L－1，－S9阳性对照：丝裂霉素C0．5mg•L－1，溶剂：0．85％NaCl溶液。

小鼠骨髓微核试验：采用小鼠尾静脉注射给药，剂量分别为425、850、1700U•kg－1（分别约相当于1／8、1／4、1／2的小鼠经静脉LD50剂量），给药容积为10mL•kg－1体重；同时设溶剂对照组和阳性对照。溶剂对照组给药方式与受试物组相同，以尾静脉注射给予溶剂（0．85％NaCl溶液）；阳性对照组以40mg•kg－1体重的剂量腹腔注射一次给予环磷酰胺，给药容量均为10mL•kg－1体重。

统计学方法Ames试验结果的评价是以比较受试物各剂量组与溶剂对照组的回复突变菌落数为基础，若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组回复突变菌落数的2倍以上，呈现可重复性，并在一定的剂量范围内存在着剂量－反应关系，则判断为阳性。染色体畸变试验的畸变率和小鼠骨髓微核试验的微核率均采用χ2检验与溶剂对照组进行比较，检验标准以P＜0．05为差异有统计学意义。

结果1Ames试验受试物各剂量组和对照组的平皿均未见污染，并且可见背景菌生长。5个菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在本实验室Ames试验历史对照范围内，并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落数与空白对照组相比显著增加，提示本试验系统符合实验要求。在最高剂量已达到每皿100U的受试条件下，未观察到受试物的抑菌现象。各剂量组受试物在加或不加代谢活化系统（±S9）时对TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535所诱发的回复突变菌落数均与溶剂对照的突变菌落数相近，并且未观察到明显的剂量－反应关系。结果见表1。

2体外培养CHO细胞染色体畸变试验染色体分析结果显示，阳性对照组受试细胞染色体的畸变率明显增高，加或不加代谢活化系统（±S9）24h染色体畸变率分别为21％和20％，不加S9代谢活化系统时的48h染色体畸变率为17％，与溶剂对照组相比均有显著差异（P＜0．05）。2．5、5．0和10．0U•mL－1受试物在加代谢活化系统（＋S9）24h染色体畸变率分别为2％、0％和3％，不加代谢活化系统（－S9）24h染色体畸变率分别为0％、2％和0％，不加代谢活化系统（－S9）48h染色体畸变率分别为1％、1％和3％。受试物各剂量组细胞染色体畸变率均小于5％，与溶剂对照组结果相比较其差异均无统计学意义（P＞0．05）。结果见表2、表3。

3小鼠骨髓微核试验的结果受试物在425、850、1700U•kg－1的剂量下对ICR小鼠骨髓嗜多染红细胞微核诱发率分别为（3．53±1．29）‰、（4．91±1．46）‰和（4．24±1．78）‰，与溶剂对照组相比均无统计学差异（P＞0．05），并且在各受试剂量下未观察到受试物对小鼠骨髓的抑制作用。结果见表4。

讨论Ames试验是被世界各国广为采用的检测物质致突变性的实验，该法比较快速、简便、敏感、经济，是经典的测试化学物或药物致突变性实验。染色体畸变分析是采用CHO细胞体外培养的方法进行的，CHO细胞在加或不加代谢活化系统（±S9）的条件下，与受试物接触一定时间后，用秋水仙碱处理，使细胞的有丝分裂停止在中期相，以增加处于中期相的细胞数；然后收集细胞，经低渗、固定、涂片和染色后，在显微镜下观察染色体数量和结构的改变，检测受试物的诱变性。微核试验是检测外来化合物对染色体损伤作用的重要方法。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。这3项实验分别从体外到体内，从微生物、离体细胞和整体动物水平上系统评价该药物的遗传毒性，是《药物遗传毒性研究技术指导原则》推荐的标准试验组合。本研究结果显示，聚乙二醇修饰降纤酶在每平皿100、20、4、0．8、0．16U的受试剂量下，在加或不加代谢活化系统（S9）时对TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535所诱发的回复突变菌落数均与溶剂对照的突变菌落数相近，显示其在受试浓度下对鼠伤寒沙门菌均无致突变性；聚乙二醇修饰降纤酶2．5、5．0和10．0U•mL－13个剂量组在加代谢活化系统（＋S9）于24h和不加代谢活化系统（－S9）于24h、48h培养的CHO细胞染色体畸变率与溶剂对照组比较均无统计学差异，显示其在受试剂量下无致CHO细胞染色体畸变效应；聚乙二醇修饰降纤酶425、850、1700U•kg－13个剂量组对ICR小鼠的微核诱发率与溶剂对照组比较均无统计学差异，显示其在受试剂量下对ICR小鼠无诱发骨髓嗜多染红细胞微核的效应。综上，本研究结果表明聚乙二醇修饰降纤酶在本实验条件下无遗传毒性。