河豚毒素采集的途径探索范文

作者：黄枝梅刘智禹苏捷吴靖娜陈绍军单位：福建省水产研究所福建农林大学食品科学学院

河豚毒素（Tetrodotoxin，简称TTX）是一种剧毒的天然非蛋白质类神经毒素，分子式为C1lH17N3O8，是典型的Na+通道阻滞剂，经腹腔注射对ICR品系小鼠的LD50为0.178μg/kg。但TTX具有特殊的生理活性和药理作用，研究表明，TTX具有镇痛消炎、降血压、抗心律失常、局麻、缓解肌肉痉挛、戒毒及抑制肿瘤等功效，其高活性和高特异性的生物特性具有潜在的医药开发价值，在临床方面也有广阔的应用前景。由于河豚毒素的中毒剂量和治疗剂量很接近，很容易使人中毒，因此，为避免河豚毒素在临床应用中产生全身毒性反应，目前已研制出河豚毒素微胶囊。目前，国内外对TTX的提取有很多报道，主要有水浴法、浸提法等。林文銮等提出以甲醇乙酸法提取TTX较完全，用活性炭脱色纯化的效果最好，但毒力有一定的损失。杨春等[5]以棕斑腹刺鲀（Lagocephaluswheeleri）为对象，研究以甲醇、乙醇、乙酸、水等4种溶剂提取TTX，结果表明，以乙酸提取效果最好。李世平等以减压浓缩法去除提取液中的乙醚，改进了乙酸提取法，提高了TTX提取得率。苏捷等采用去除油脂、蛋白、活性炭吸附、阳离子交换、分子筛层析等方法得到高纯度的河豚毒素。超声波提取法是利用超声波具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度和增大介质的穿透力以提取生物有效成分的方法，与传统浸提法相比，超声波提取具有提取率高，提取时间短，不改变所提取成分的化学结构和生理活性，节约原材料和溶剂等优点。有关超声波提取TTX的研究较少，仅见阚丽丽等以河豚内脏为原料，研究超声波提取TTX时的超声时间、乙酸用量、提取次数等工艺条件的提取效果的报道，该研究表明，以超声法辅助提取河豚毒素的含量优于水浴法及回流提取法。本研究以月腹刺鲀（Gastrophysuslunaris）卵巢为原料，研究超声波辅助提取TTX的工艺条件，用二次旋转回归实验建立液料比、超声温度、超声时间与提取量的关系模型，并用响应面法对提取工艺条件进行优化，旨在为TTX的工业化提取提供依据。

1材料与方法

1.1材料

月腹刺鲀（Gastrophysuslunaris），广东深圳沿海；雄性昆明小鼠，20g左右，厦门大学医学院。药品试剂：乙酸、甲醇、无水乙醇等，分析纯（AR），汕头市西陇化工厂有限公司；TTX标准对照品，纯度≥98%，河北省水产科技开发公司。仪器设备：KQ-100DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DK-S16型电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；TDL-40B台式离心机，上海安亭科学仪器厂；R系列旋转蒸发器，上海坤生科技有限公司。

1.2方法

1.2.1样品处理称取10.0g月腹刺鲀卵巢，用组织匀浆器打碎，加入适量有机溶剂，采用超声波辅助提取，冷却后以4000r/min离心5min，上清液通过快速定性滤纸过滤，滤液以乙醚脱脂，定容，4℃下保存备用。

1.2.2超声波提取的单因素实验

1.2.2.1提取溶剂的选择固定液料体积质量比（mL/g，下同，下称“液料比”）3∶1，超声温度40℃，超声功率60W，超声时间30min，提取1次，分别以乙酸、乙酸甲醇和乙酸乙醇水溶液为提取溶剂，研究不同溶剂对TTX提取效果的影响。

1.2.2.2液料比对TTX提取效果的影响以体积分数0.1%的乙酸水溶液为提取溶剂，固定超声温度40℃，超声功率60W，超声时间30min，提取1次，改变液料比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1，研究液料比对TTX提取效果的影响。

1.2.2.3超声温度对TTX提取效果的影响以体积分数0.1%的乙酸水溶液为提取溶剂，固定液料比3∶1，超声功率60W，超声时间30min，提取1次，改变超声温度为20、30、40、50和60℃，研究超声温度对TTX提取效果的影响。

1.2.2.4超声功率对TTX提取效果的影响以体积分数0.1%的乙酸水溶液为提取溶剂，固定液料比3∶1，超声温度30℃，超声时间20min，提取1次，改变超声功率为40、60、80和100W，研究超声功率对TTX提取效果的影响。

1.2.2.5超声时间对TTX提取效果的影响以体积分数0.1%乙酸的水溶液为提取溶剂，固定液料比3∶1，超声温度30℃，超声功率60W，提取1次，改变超声时间为10、20、30、40和50min，研究超声时间对提取效果的影响。

1.2.2.6提取次数对TTX提取效果的影响以体积分数0.1%的乙酸溶液为提取溶剂，固定液料比3∶1，超声温度30℃，超声功率40W，超声时间20min，分别提取1次、2次、3次和4次，研究提取次数对TTX提取效果的影响。

1.2.3TTX含量的测定TTX测定采用昆明小鼠生物检测法[7]，在检测过程中，每个TTX样品分别腹腔注射3只小鼠以检测TTX含量，即分别进行3次检测。除1.2.2.3中的温度实验外，其余数据均取3次检测的平均值。标准曲线的绘制及检测步聚参照吴韶菊[11]。以小鼠平均死亡时间的倒数为横坐标，小鼠单位体重TTX注射剂量（以20.0g为小鼠单位体重）为纵坐标，作标准曲线（图1），其线性回归方程为y=3360.6x+154.35，r=0.9971。

1.2.4TTX得率的计算计算公式：

1.2.5实验设计通过单因素实验，确定影响TTX提取的关键因素，并采用三元二次回归旋转组合设计对3个主要因素进行回归实验，绘制响应面图，研究影响较大的因素的主效应和交互效应，以求得最佳工艺。

2结果与讨论

2.1超声波提取TTX的单因素实验

2.1.1提取溶剂的选择图2表明，3种溶剂提取TTX的效果不同：乙酸甲醇的提取效果最好，得率为58.68μg/g，乙酸水次之，乙酸乙醇的提取效果最差。但是，由于乙酸水的得率仅比乙酸甲醇低1.95μg/g，考虑到甲醇毒性较强，可能对小鼠检测结果产生影响，因而选择体积分数0.1%的乙酸水溶液作为提取溶剂。

2.1.2液料比对TTX提取效果的影响图3可见，随着液料比的递增，TTX得率呈不断增加趋势。当液料比为3∶1时，TTX得率为57.46μg/g；当液料比超过3∶1时，TTX得率增加趋于平缓，说明此时溶剂已基本将目标物质提取出来。一般来讲，液料比越大，目标物质提取越彻底，提取效果也越好。但溶剂用量大必然造成后来浓缩工艺的延长，使得整体工作效率下降，成本上升[12]。因此，选择液料比3∶1。

2.1.3超声温度对TTX提取效果的影响表1表明，30℃的超声温度提取效果最好，TTX得率为58.89μg/g。20℃与30℃下提取效果差异极显著（P<0.01），30℃与40℃下提取的TTX得率也存在极显著差异（P<0.01）。但50℃时的TTX提取量明显下降，与60℃不存在显著差异（P>0.05）。因此，采用超声温度为30℃。

2.1.4超声时间对TTX提取效果的影响图4可见，10～20min超声期间，TTX得率明显升高，20min时得率达到最大值59.58μg/g；再延长提取时间得率反而降低。因此，选用20min进行超声提取比较合适。

2.1.5超声功率对TTX提取效果的影响图5表明，TTX的得率随着超声功率的增大有所下降，当功率为40W时，TTX得率最高，为60.24μg/g。因此，选择超声功率为40W。

2.1.6提取次数对TTX提取效果的影响图6表明，随着提取次数从1次增加到4次，TTX得率从60.12μg/g增加至60.85μg/g，增加的幅度不大。考虑到提取次数越多，原料中其他成分溶出也越多，增加了分离纯化的难度。从经济效益和时间的角度考虑，提取次数选择1次。

2.2超声波提取河豚毒素的二次回归实验

在单因素实验的基础上，得到影响TTX提取量的3个主要因素为液料比、超声温度和超声时间，与阚丽丽的实验设计略有不同[10]。根据单因素实验确定各因素的上下水平，并按照三元二次回归旋转组合设计原理设计实验。实验设计方案及结果如表2所示。利用相关程序对所得数据进行模拟，得液料比（X1）、超声温度（X2）和超声时间（X3）影响TTX得率（Y）的回归方程如下：表3回归模型方差分析结果表明，各因素对TTX得率的影响程度依次为超声温度、液料比、超声时间。其中，超声温度和液料比的影响极显著（P<0.001），直接关系到TTX的提取得率。在α=0.01显著水平上剔除不显著因素项，得到简化后的回归方程：

2.3超声波提取工艺的响应面法优化

2.3.1单因子效应分析对上述数学模型进行降维分析，将三因素中的两个因素固定在零水平，观察其中一个单因素在各水平上对TTX得率的影响效应，得到以其中一个因素为决策变量的偏子回归模型，结果如图7所示。液料比曲线先随着编码的增加而增大，在零水平时达到最大值，超过此水平曲线呈缓慢下降趋势；温度曲线随着温度的升高得率增加很快，在编码值为1.5左右出现峰值，然后趋于缓和；超声时间曲线在实验所给定的范围内变化较小，零水平左右有最大值。因此，在采用超声波提取TTX的过程中，要特别关注温度的取值。

2.3.2因素间交互作用响应面分析响应面图形是特定的响应值对应的因素构成的一个三维空间在二维平面上的等高线，可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响[8]。分别将液料比、超声温度和超声时间3个因素中的一个固定为零水平，根据上述回归方程Y1作出响应面分析图和等高线图见图8~10。图8~10表明，各实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是二次关系。当液料比在零水平左右，超声温度在+1.5水平左右，超声提取时间在+0.5水平左右，拟合曲面有最大值。为进一步确定超声提取参数的最佳值，对拟合方程求一阶偏导，解方程得X1=0.05、X2=1.5、X3=0.42时，Y1=62.61。即当液料比为3.03∶1，控制超声温度39℃，提取22.5min，TTX得率最高为62.61μg/g。对液料比3∶1、超声温度40℃、提取22min进行验证实验，TTX的平均得率为63.57μg/g，优于回归实验中的任一组，与预测量的相对标准偏差（RSD）为1.08%，表明该工艺是稳定可行的。

3结论

1）提取溶剂选择的实验结果表明，乙酸甲醇水溶液的提取效果最好，乙酸水溶液提取量比乙酸甲醇溶液低1.95μg/g。考虑到甲醇的毒性较强及成本较高等原因，实验选择体积分数0.1%的乙酸水溶液作为提取溶剂。

2）TTX提取量随着提取次数的增加而增大，但增加幅度不大。提取次数越多，原料中其他成分溶出也越多，增加了分离纯化的难度，故提取次数选择1次。

3)液料比、超声温度和超声时间是TTX超声提取的主要影响因素，与TTX得率之间的回归模型为：Tukey法方差分析表明，影响TTX得率的各因素大小依次为：液料比、超声温度、超声时间。方程R2为0.9824，表明回归方程极显著，对TTX实际提取结果有良好预测作用。

4）超声波辅助提取河豚毒素的最佳工艺条件为液料比3∶1，超声温度40℃，超声时间22min，该工艺条件下的提取率达63.57μg/g。