伯氏疟原虫哌喹抗性系病理学特征及抗性研究范文

摘要：

目的观察伯氏疟原虫（Pb）ANKA株哌喹抗性系（PQR）感染小鼠组织病理学变化特征，比较与哌喹敏感系（PQS）的差异，探讨其抗性机制。方法实验小鼠随机分为A（PQS）、B（PQR）及C（正常对照，NC）三组，取肝、脾、脑及肾组织，10%福尔马林固定后石蜡包埋，4μm切片，苏木精一伊红（Haematoxylin-eosin,HE）及吉姆萨（Giemsa）染色，镜下观察其组织病理学改变。结果与PQS组比较，PQR组疟原虫感染红细胞（pRBC）及疟色素（HZ）在各器官组织中出现晚，增殖缓慢，数量明显偏少，在17d增至峰值时仍明显少于PQS组6d时，22d时开始下降。各组织的炎性病变随感染天数的延长而变化：早期较轻，呈渐进性发展，17d时达到高峰，22d时炎症减轻，组织损伤呈恢复趋势，其两组肝、脾组织中炎性细胞的浸润程度在6d时未见明显不同。脑组织的炎性反应、疟原虫浸润及组织损伤程度均显著轻于PQS组。结论PQR系的毒力下降、致病力降低表象的组织病理学特征为：肝、脾、脑和肾组织中pRBC及HZ浸润量明显偏低，炎性反应、原虫数量的变化呈逐渐增加、降低、趋向恢复的动态过程，未见明显的脑型疟的组织学变化。

关键词：

伯氏疟原虫；哌喹抗性；疟色素；组织病理学；苏木精-伊红染色法

磷酸哌喹（Piperaquinephosphate,PQ）是疟疾防治的主要药物，单用容易产生抗药性，世界卫生组织提出与青蒿素的衍生物双氢青蒿素配伍制成的复方药物-科泰复，是目前流行区抗疟的主要一线药物[1]。尽管复方药物的应用已有效延缓了疟原虫对抗疟药抗性的产生，但对疟原虫抗性机制研究依然迫在眉睫，PQ的抗性机制亟待阐明。在前期的PQ抗性机制研究中，课题组通过对伯氏疟原虫（Plasmodiumberghei，Pb）ANKA株哌喹敏感株（PQsensitive,PQS）感染小鼠采用PQ连续加压的方法，建立了Pb抗哌喹（PQresistant，PQR）系感染小鼠模型[2]。观察发现，随着抗性的产生，PQR模型小鼠疟原虫毒力明显减弱，致病力下降，对小鼠影响由致死性变为生存期显著延长甚至存活[2]；感染小鼠的脾淋巴细胞增殖水平、NO水平和IFN-γ含量均显著高于PbANKA株PQS系感染小鼠，并可诱导小鼠产生一定保护性免疫反应[3]；进一步观察发现，感染早期6d时脾细胞中TNF-a及INF-γ细胞因子分泌细胞数量在PQR组明显高于PQS组[4]。PbANKA株对PQ产生抗性后对小鼠主要组织器官所造成的影响及其组织病理学特征如何？据研究资料报道，恶性疟原虫感染可造成严重的组织器官病理损害及功能障碍或导致脑型疟的发生，是疟疾病人死亡的重要原因之一[5-7]。由此推测，PQR系感染小鼠组织病理学损伤与致死性PQS系感染小鼠相比可能不同。本文利用该鼠疟模型，通过常规苏木精—伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色法并辅以对组织中的疟原虫有良好染色效果的优化吉姆萨（Giemsa）组织染色法[8]，对PQR组以及PQS组感染小鼠的肝、脾、脑和肾组织进行了病理组织形态学观察，旨在通过比较PQR与PQS感染小鼠组织病理学变化特点及差异，从组织学的角度探讨疟原虫对PQ的抗性相关机制，为PQR抗性相关感染免疫调节机制的阐明，提供进一步的实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1PbPQS和PbPQR

PbPQS系由海南省热带病重点实验室惠赠，以低温冷冻和鼠间血传交替保种；PbPQR系由海南医学院科学实验中心建立及保种[2]。

1.1.2实验动物及分组

80只雄性瑞士种昆明远交系小鼠购自广州中山大学实验动物中心，6~8周龄，体重为（25±2）g。随机分为3组，即A组（PQS组）10只、B组（PQR组）和C组（正常对照组，NC）各35只。1.1.3试剂吉姆萨（Giemsa）粉剂购自国药集团化学有限公司，苏木素（Hematoxylin）、伊红（Eosin）购自阿拉丁试剂公司。1.2方法1.2.1实验动物感染A、B组分别腹腔感染PQS系和PQR系1×107个红内期原虫（200μL血），C组腹腔注射200μL生理盐水。A组小鼠在感染后3、6d,B、C组小鼠在感染后3，6，9，12，15，17及22d脱颈处死，取肝、脾、脑和肾组织制片。

1.2.2染液配制

HE染液采用改良Carazzi苏木素染液配制法配制[9]。Giemsa染液原液根据文献[10]配制后，用pH6.8的磷酸盐缓冲液30倍稀释后做为组织切片染色液[8]。

1.2.3HE染色方法

小鼠肝、脾、脑及肾组织经石蜡包埋后4μm切片，60℃烤箱30min，二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水化，苏木素染液中5min，水冲洗，1%盐酸乙醇中分化3s，水冲洗，pH7.2PBS中返蓝30s，水冲洗，1%伊红中染色20s，水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯中透明，中性树胶封固后镜检。

1.2.4Giemsa染色方法

组织切片的Giemsa染色脱蜡、水化过程与HE染色同，其染色为30倍稀释染液室温染色5min，水冲洗，水溶性封片剂封固后镜检。1.2.5分析方法采用半定量的方法对pRBC、HZ及炎性细胞的组织中浸润程度进行分析判断，每个标本随机选择5个高倍（×400）及油镜（×1000）视野观察分析，每组取5个标本的均数作为该组的半定量结果。

2结果

2.1感染小鼠一般情况PQS组

小鼠感染6d时均出现体重下降，精神萎靡、缩头不动，皮毛松弛、尾巴发青触及无热度、对外界刺激反应下降等濒死症状；PQR组小鼠感染6d未见明显变化，仅个别鼠在感染17d后出现上述症状。

2.2正常对照组组织HE及Giemsa染色镜检正常对照小鼠（C组）肝、脾、脑及肾组织光学显微镜下结构正常，组织细胞轮廓清晰完整，见图1A、图2A、图3A、图4A。

2.3PQS和PQR组肝脏组织HE及Giemsa染色镜检PQS组

3d时可见肝窦轻度充血，肝细胞水肿，局部呈颗粒或气球样变性，肝窦及汇管区可见明显的中性、淋巴、单核等炎性细胞浸润，个别成团分布，枯否氏细胞增生，可见个别位于红细胞内的疟原虫（ParasitisedRedBloodCell，pRBC）及疟色素（MalariaPigmentHemozoin，HZ）颗粒。6d时肝细胞变性、肝窦充血加重，以淋巴细胞、单核细胞为主的炎性细胞大量增加，肝窦内可见大量的pRBC及呈点状或团块状分布的HZ，枯否氏细胞数量明显增多，体积增大，大量细胞胞浆内吞噬有疟原虫、大小不等的HZ颗粒及红细胞碎片；PQR组肝窦及汇管区的中性、淋巴、单核以及枯否氏细胞浸润从3d时开始逐渐增加，感染第6、9d时，炎性细胞以淋巴及单核细胞增加为主，少量中性粒细胞，偶见个别pRBC；9d开始可见局部肝组织充血，并逐渐加重，个别肝细胞结构疏松，体积增大，水肿变性；12d时其汇管区及肝小叶边缘区炎性细胞浸润更为明显，单核细胞比例进一步增加，个别样本的部分肝小叶结构破坏，pRBC或疟原虫及HZ增加，部分聚集成团，枯否氏细胞对其吞噬活跃；17d时以上变化达到高峰，22d时炎性反应、pRBC及HZ明显降低，浸润细胞以单核细胞为主,见图1、表1。

2.4PQS和PQR组脾脏组织HE及Giemsa染色镜检PQS组

3d时镜下可见白髓增大，淋巴细胞增加，脾窦内可见少量pRBC及HZ颗粒。6d时白髓继续增大，部分红、白髓界限不清，可见大量pRBC、HZ及红细胞碎片，HZ呈颗粒状或成团分布，巨噬细胞增多，内见吞噬的疟原虫、HZ与红细胞碎片。PQR组3d镜下可见个别脾脏白髓增大，其他未见明显变化，6d时可见个别pRBC，巨噬细胞增加，9d时脾脏充血严重，个别红、白髓界限不清，巨噬细胞大量增加，体积增大，胞体内可见吞噬的疟原虫、HZ和红细胞碎片，12d时pRBC及HZ进一步增加，15d始可见网状细胞逐渐增加，以上的变化除网状细胞外至17d时达到峰值，22d时脾脏的炎性细胞浸润减轻，pRBC及HZ明显减少，网状细胞未见下降,见图2、表1。

2.5PQS和PQR组脑组织HE及Giemsa染色镜检PQS组

3d时镜下可见软脑膜下及皮质组织内毛细血管充血，偶见pRBC。6d时充血进一步加重，pRBC及HZ浸润增加，毛细血管及小血管内pRBC及不含原虫的红细胞聚集，并可见与血管内皮细胞粘附，局部脑组织可见小出血点，多量单核、淋巴细胞和巨噬细胞浸润。PQR组3、6d未见明显变化，9d时可见局部脑组织结构疏松水肿，毛细血管充血，少数炎性细胞浸润，偶见pRBC；炎性细胞在17d时达到最高，并从早期以淋巴细胞为主转为以单核细胞为主，可见个别疟原虫；22d时水肿减轻，炎性细胞明显减少，偶见个别疟原虫,见图3和表1。

2.6PQS和PQR组肾脏组织HE及Giemsa染色镜检PQS组

3d局部组织肾小球及肾间质内毛细血管充血扩张，可见个别pRBC。6d时充血加重，部分肾组织极度充血，肾小管细胞水肿，肾小管管腔变小，部分样本大片肾脏组织结构破坏及肾小管细胞坏死，肾小球、肾小管及间质内可见明显的淋巴、单核-巨噬细胞浸润及大量pRBC及HZ。PQR组镜下3d未见明显变化，6d时可见个别炎性细胞浸润，随后逐渐增加，12d时可见个别pRBC及HZ，局部组织充血，至17d时充血更为严重，淋巴、单核-巨噬细胞、pRBC及HZ增至峰值，并可见部分肾小球扩大，22d时肾组织炎性细胞浸润减少，充血明显减轻或基本消失，pRBC及HZ浸润亦明显下降，见图4、表1。

3讨论

PbANKAPQR小鼠显著的生物学特征是病变症状轻，原虫感染率低，存活时间长甚至可清除虫体存活[3-4]。与PQS感染小鼠比较，PQR组在感染6d时未出现类似典型的脑型疟症状及体征，其组织病理检查结果显示脑组织的炎性反应、pRBC浸润及组织损伤程度明显轻于PQS组，肾组织亦显示相似的组织病理变化趋势，肝、脾组织在感染6d时镜下观察在pRBC及HZ的浸润方面明显不同，PQS组pRBC及HZ清晰可见，大量存在，而PQR组镜下仅见个别pRBC；在组织的炎性反应方面两组均增强，无明显差异，炎性细胞的浸润均以淋巴、单核-巨噬细胞为主。由于PQS组一般只能存活6~9d，故9d后仅对PQR组各组织进行了动态观察。PQR组9d起炎性反应逐渐增加至17d时达峰值随之在22d时下降。值得注意的是，两组小鼠6d时肝、脾组织中炎性细胞增加未见明显不同，且均以淋巴、单核-巨噬细胞为主，但其感染小鼠原虫浸润、病情发展截然不同。大量的研究已经证明：不同类型的淋巴、单核-巨噬细胞等免疫细胞在疾病发展的不同时期发挥着不同的作用[11-12]，拟或抑制及清除原虫，遏制虫体血症，降低炎症反应，发挥免疫保护作用，亦可发挥促炎功能，诱发免疫病理反应，阻碍机体清除原虫，使疾病恶化。对于PQS及PQR两组感染小鼠淋巴、单核-巨噬细胞具体的种类分型有何不同、各自的作用还有待进一步的研究确定。另外，在PQR组各组织中pRBC及HZ的浸润方面，虽然逐渐增加，在17d时达到峰值，但仍少于PQS组6d时，并在22d时下降减少，这种组织病理学的变化特点与小鼠感染后病情的转归及原虫毒力明显减弱、致病力下降的抗性表征基本一致[2]。疟原虫感染导致死亡的主要原因是脑型疟并发多器官功能障碍综合征[7]，脑型疟的发病机制与机械阻塞及免疫病理相关，疟原虫感染并在脑部粘附，诱导宿主抗感染的免疫细胞迁移至脑部并被激活，免疫细胞又促进原虫在脑部粘附，最终使宿主脑部受到机械和免疫病理双重损伤而发生脑型疟[13]，聚集到脑部的pRBC数量及原虫的侵袭力是脑型疟发生的关键因素。实验显示：PQS组脑组织内可见明显的pRBC及HZ浸润，小血管内pRBC及红细胞聚集，并可见与血管内皮细胞粘附；PQR组则在6d时无明显改变，直至22d脑组织中原虫始终很少。PQS与PQR两组在感染相同宿主后的不同转归，即死亡与存活时间的不同，从脑组织病理特征的差异亦得到了证明。HZ是疟原虫消化血红蛋白后形成的一种高铁血红素聚合物，HZ的形成对于疟原虫来说是一种将有毒的游离血红素进行解毒的过程[14]，HZ与疟原虫的毒力有关，其含量与疾病的严重程度相关，脑型疟及病情较重者.含量明显高于病情较轻者[15]。实验结果显示：各组织切片中PQR组的HZ明显少于PQS组，以往的末梢血片镜检亦证实PQR株原虫中HZ的形成减少或消失[2-3]，这些为PbANKAPQR系毒力及致病力降低提供了佐证，但有关疟原虫抗性与HZ的相关性及其机制还有待深入研究。PbANKAPQR系鼠疟模型的组织病理改变与PQS系相比有明显差别，该研究结果为疟原虫的抗性机制的阐明提供了组织学实验依据，然而疟原虫的抗性机制是十分复杂的课题，还需结合感染免疫调节机制等进行深入研究。

参考文献：

[2]郭虹,周利民,潘在用,等.伯氏疟原虫哌喹抗性系的建立及其抗性表型特征观察[J]海南医学院学报,2011,17(7):865-869.

[3]黄宪希,周利民,易国辉,等.伯氏疟原虫ANKA株抗哌喹系小鼠模型免疫学分析.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2012,30(1):12-16,19.

[4]黄宪希,周利民,易国辉,等.伯氏疟原虫抗哌喹系小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌细胞的抗性免疫调控作用[J].海南医学院学报,2015,21(5):577-581,587.

[5]刘太平,付雍,徐文岳.脑型疟发生的免疫病理机制[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2011,29(1):64-67.

[6]刘曼，陈莹，赵莹，等.昆明小鼠对伯氏疟原虫的易感性和组织病理研究[J].热带医学杂志,2012,12(4):363-365,381.

[7]陈川碧，王万壮.脑型疟疾致多器官功能障碍综合征38例报告[J].中国热带医学,2010,10(4):462-463.

[8]黄宪希,周利民,易国辉,等.疟原虫感染组织切片吉姆萨染色法的建立及优化[J].中国热带医学,2015,15(1):91-93.

[9]张赛霞,李文.改良使用Carazzi苏木素染液的体会[J].解剖科学进展,2000,6(2):192.

[10]胡宏慧,孔今城.GIEMSA法检测胃幽门螺杆菌[J].上海医学，1999,22(12):762.

[11]陈光，刘蕾.疟疾发病中树突状细胞/调节性T细胞/Th17细胞的功能变化及其交叉调控机制[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2014,32(4):304-307.

[12]周宪宾，姚成芳.巨噬细胞M1/M2极化分型的研究进展[J].中国免疫学杂志,2012,28(10):957-960.

[13]付雍,丁艳,徐文岳.脑型疟发生机制研究进展[J].中国病原生物学杂志，2015,10(2):192-194.

[14]姚美雪,王恒.疟色素在疟原虫检测方面的应用研究进展[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2014,32(1):68-71.

作者：黄宪希 周利民 沈笑 易国辉 薛伟玲 郭虹 单位：海南医学院科学实验中心