蛋白质在病理学护理的探究进展范文

本文作者：朱永生蔡秋华罗曦王颖姮吴方喜张建福谢华安单位：福建省农业科学院水稻研究所福州国家水稻改良分中心／福建省作物分子育种工程实验室／福建省水稻分子育种重点实验室福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地

人类基因组计划自20世纪90年代初开展以来，取得了许多重要的研究进展，获得了包括人类、水稻、拟南芥等多种模式生物在内的基因组DNA的全序列［1－4］，这对生命科学的发展具有划时代的意义，生命科学从此进入了后基因组时代。

然而，这些令人振奋的进展也随之产生了新问题，由基因编码的蛋白质与基因本身不同，其在生物体内的表达和功能具有复杂的动态性、时空性，以及1个基因对应多个蛋白质，即mRNA与蛋白质之间并非简单的一一对应关系，蛋白质的结构也不可能依靠DNA序列来解析。大量的新基因及蛋白质数据不断涌现，就需要重新认识这些基因与其所编码的蛋白质的结构及它们所执行的功能等，从而将各个蛋白质之间的上、下游关系和相互作用解释清楚。此外，蛋白质在生物体合成之后，对于蛋白质翻译后加工、修饰、蛋白质之间的相互作用、功能以及其运输、在生物体的组织和细胞定位、蛋白质结构的形成、代谢途径等都无法从基因组水平的研究上进行解释。所以，直接在蛋白质水平上的研究对于深入剖析生物体的运行机制具有重要的意义［5］。

在这个研究背景下，1994年MarcWilkins在意大利的二维凝胶电泳（Two－dimensionalgelelectrophoresis，2－DE）会议上首次提出了蛋白质组（Proteome）的概念［6］。它是指生物体的全部蛋白质组成及其表达方式。蛋白质组研究目前虽然尚处于起始阶段，但已经获得了很多重要的研究成果。当今蛋白质组学的主要任务是不断完善和更新蛋白质组研究技术和手段，大量进行蛋白质分析。在植物病理学的应用研究中，可以通过比较正常组织和疾病组织的蛋白质表达情况，鉴定出特异的病程相关蛋白质，而这些特异蛋白质也可以作标记来辅助选育抗病品种，从而将其应用于农业生产实践［7］。

1蛋白质组学研究手段

目前，蛋白质组的研究内容主要分2个方面。

一方面，通过双向电泳技术获得正常（健康）生理条件下的生物体、组织或某些特定细胞的蛋白质组电泳图谱，并将这些图谱数据作为待检测生物体、组织或某些特定细胞的参考电泳图谱。另一方面则是比较在非正常（疾病）生理条件下生物体蛋白质组所发生的变化。如蛋白质表达量的变化、组织表达特异性的变化、蛋白质翻译后修饰的变化以及在细胞或亚细胞水平上的定位变化等。通过对双向电泳图谱上具有显著差异表达的蛋白质的分析鉴定，可以对编码该蛋白质的基因进行研究，延伸对该基因功能及结构的了解，也可以为功能蛋白质组学的研究提供参考，甚至发现新的基因和蛋白质，完善已有基因组和蛋白质组数据库等［8］。目前，蛋白质组学的主要研究技术包括3个方面，即包括蛋白质的分离、鉴定技术和生物信息学技术。

1．1蛋白质分离技术

双向电泳技术作为目前蛋白质组学中应用最为广泛的实验技术，它具有实验流程成熟、分辨率高、重复性好的特点，是一种成熟的蛋白质组学研究技术［9］。双向电泳的基本原理是，根据所有蛋白质的等电点和分子量大小，进行2次电泳将其分离。双向电泳的第一向是等电聚焦（Isoelectricfocusing，IEF），即按照蛋白质的等电点进行分离，分为固相化pH梯度等电聚焦和载体两性电解质pH梯度等电聚焦2种，目前广泛采用预制胶条进行固相化pH梯度等电聚焦［10］。第二向是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），即对蛋白质分子量的大小进行分离，一般采用垂直电泳或水平电泳。由于双向电泳利用了蛋白质的两个彼此不相关的而对蛋白质的性状又极其重要性质对其进行有效分离，因此该方法具有较高的分辨率，一般能分辨出2000个左右蛋白质点，最高可以达到11000个蛋白质点的分辨率［11］。

近年来，随着生命科学的不断发展，越来越多的交叉学科和实验技术也随之出现，如一些新的蛋白质分离方法，亲和色谱、多维色谱毛细管电泳等。这些新技术虽然不能完全代替双向电泳技术，但可以在一定程度上弥补双向电泳的一些不足。从目前的发展趋势来看，液相色谱－质谱联用已经成为发展较快的蛋白质组学分离技术之一，并越来越受到蛋白质组学研究者的关注。该技术最突出的优势是对生物体蛋白质组进行分析时的歧视效应大大减小，该技术可以同时实现蛋白质的分离和鉴定的在线联用，因此，液－质联用技术的发展有利于蛋白质组研究向高通量化和自动化的方向发展［12］。

然而，双向电泳技术作为最成熟的蛋白质组学研究方法，可以既快又全面地获取生物体蛋白质组变化的宏观信息，同时也可以较好地与后续的分析方法串联，从而有效地进行微观分析，并且该方法有很好的分离能力，分辨率较高，还具有一定的高通量优势［13］，因此，目前双向电泳技术仍然是蛋白质组学的核心技术之一。

1．2质谱技术

利用质谱技术对已通过双向电泳等技术分离的蛋白质进行鉴定是蛋白质组学研究中的关键步骤。20世纪80年代末，日本科学家田中耕一和美国科学家JohnBFenn分别开发出基质辅助激光解吸电离技术（matrixassistedlaserdesorptionionization，MALDI）［14］和电喷雾电离（electrosprayionization，ESI）［15］2种软电离技术，推动了生物质谱（Bio－MS）的发展，使传统的主要应用于微观物质研究的质谱技术的应用性发生了巨大的变革［13］。MALDI，ESI－MS等技术的出现促使双向电泳向与质谱兼容的方向发展，也推动了质谱仪的核心装置即质量分析器的改进，使生物质谱技术更有效地应用于蛋白质组的研究领域。用于蛋白质组研究的质谱分析仪有飞行时间、四极离子阱、傅立叶变换离子回旋共振、四极杆等几种选择［13］。生物质谱主要通过对蛋白质、多肽等的质量测定以及肽质量指纹图谱测定和氨基酸序列测定，对双向电泳技术分离的蛋白质点的定量蛋白质组进行分析、鉴定、蛋白质的翻译后加工、修饰以及蛋白质相互作用等研究。

目前，生物质谱被认为是高通量、高效进行蛋白质鉴定的首选工具之一，它与很多分离方法进行了有机的结合，并得到了广泛的应用，如与双向电泳、CE、多维色谱的联用或质谱本身的联用等，是复杂蛋白质样品分离分析时不可替代的方法。但在目前的应用中，该方法还存在一些技术上的瑕疵，如质谱的定量问题等。另外，近年来荧光双向差异凝胶电泳技术、激光捕获微切割技术（lasercapturemicrodissection，LCM）、表面增强激光解吸电离－飞行时间－质谱（surface－enhancedlaserdesorptionionizationtime－of－flightmassspectro－metry，SELDI－TOF－MS）和稳定同位素特征标签生物质谱技术等也得到了较快的发展和广泛的应用［16］。相信随着生物质谱和相关技术的不断完善和改进，这些方法必将会在蛋白质组学的研究中更好地发挥作用，不断满足高效、高通量和自动化鉴定、筛选蛋白质的需求。

1．3生物信息学

生物信息学是近几年发展起来的一门新兴的交叉学科，它由生物技术与计算机科学技术以及应用数学学科等有机组成。它通过对蛋白质组研究采用的试验方法（如双向电泳、质谱分析、色谱分析、酵母双杂交、蛋白质微量测序等）所获得的试验图谱、序列等数据进行统计、检索、分析等，以揭示这些数据中所蕴含的生物学意义，从而解释一些有规律的生命现象［17］。生物信息学在蛋白质组学中的的研究内容主要包括：大规模蛋白质组学试验数据的获得，将试验数据经过软件处理成具有生物学意义的试验结果，以及对试验结果分析、解释，最后将获得的信息进行以及对上述过程的管理等。

蛋白质数据库不仅标志着蛋白质组学的研究水平，也是蛋白质组学研究的基础。目前，蛋白质结构数据库主要是美国国家实验室的PDB（ProteinDataBank），蛋白质序列数据库主要是瑞士日内瓦大学的SWISS－PROT［18］。生物信息学技术的快速发展已为蛋白质组学研究提供了许多高效、便利的分析软件，尤其是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，最近发展了一种分析技术，可以直接搜寻基因组数据库，对质谱数据进行基因注释和判断复杂的拼接方式，因此，生物信息学的进展为蛋白质组学、基因组学、生物芯片技术等生命科学的前沿领域的发展起了较大的推动作用［19］。可以预测，随着生物质谱技术在蛋白质组学研究中的更大规模的应用，规模化质谱分析会产生海量的数据，这将会有效促使更多更完善的数据库系统的建立［20］。

2蛋白质组学在植物病理学上的运用

植物蛋白质组学研究随着拟南芥和水稻等模式植物的基因组序列公布后逐渐活跃起来。植物抗病机制及抗病性研究仍是当今植物病理学和植物抗病育种研究的重要领域之一［21］。自然界中生长的植物时刻处于各种微生物的包围环境之中，其中绝大多数植物不被微生物所侵染，表现出抗病性，并在体内产生相应的病原物相关蛋白质（pathogenesis－relaedproteins，PR蛋白）来抵御微生物的入侵［22］。当病原菌侵染植物后，植物与病原物之间的相互作用是一个复杂动态过程，植物与病原物的识别、互作在特定的细胞、特定的时间、特定的组织或有机体中并非所有的蛋白质都表达，而是按照寄主植物防御反应的需要进行特异的表达和运转。蛋白质是生物体最终功能的执行者，由于DNA序列信息与蛋白质序列之间不是一一对应的关系，也不能说明蛋白质的翻译后加工、修饰。因此，植物与病原物之间互作的动态过程不能通过分析植物寄主或病原物的基因组信息来解释。所以，只有将蛋白质组学研究与基因组学的研究结果有机结合，才能更好地从分子水平解析寄主与病原物互作的内在机制，同时为植物的抗病育种研究提供理论依据。

2．1蛋白质组学在植物与病原物互作系统中的应用

植物蛋白质组学的发展必将对植物学科及植物病理学科的研究与发展产生重要的推动作用。由于蛋白质组学研究技术在植物学科上取得了重要的研究进展，有许多成功的研究应用案例，再加上蛋白质组学研究技术具有高分辨率、高通量的优势，很多学者已经将这门技术应用于植物病理学的研究，并已取得了较大的进展。

我国学者廖玉才等构建了大麦抗、感白粉病的近等基因系，并对1叶期的幼苗进行了白粉病的接种试验，对接种48h后的幼苗叶片进行了蛋白质组学分析，研究结果表明，抗病系诱导表达了在未接种对照中未出现的蛋白质点；而感病品系在pH6．0附近诱导表达的蛋白质明显增多，感病系在pH8．8处在蛋白质的表达量大幅提高，而且蛋白质种类也比抗病品系有所增加［23］，该研究也是蛋白质组学在植物病理学研究中早期的应用。陶全洲等在离体条件下，用双向电泳技术研究稻瘟病菌Magnaportheoryzae与水稻在接触反应初期阶段的蛋白质表达变化情况，以寻找可能参与寄主与病原物相互识别的病程相关蛋白质，研究结果表明，病原菌与寄主发生接触反应后，有2个组成型蛋白质被诱导表达，即该蛋白质在抗病品种和感病品种中都有表达，以此推测该蛋白可能参与寄主与病原物的接触时的信号识别等，在该研究中，还有2个蛋白质与孢子或菌丝体混合后下调或消失［24］。郑用琏等通过双向电泳技术研究了小麦在受到褐斑病菌浸染后，其诱导表达了2个特异性病程相关蛋白质，进行其氨基酸序列分析后，合成简并核酸探针，从蛋白质序列分析入手分析抗病相关基因，为从蛋白质水平到DNA水平的研究开创了新的研究思路，为该方向的研究提供了借鉴［25］。李跃建等用双向电泳技术研究了条锈菌侵入后小麦体内蛋白质的表达情况，研究发现抗小麦条锈病品种川麦107和感条锈病品种80－8在小麦条锈菌侵入后，体内蛋白质表达变化差异非常显著［7，26］。梁根云等运用双向电泳技术分析了2个小麦品种（川麦107和80－8）的未接种对照和条锈菌侵染发病14d后的叶片差异表达蛋白质，从双向电泳图谱上找到9个显著差异表达的蛋白质点，通过谱技术鉴定，获得6个蛋白质点的肽质量指纹图谱（PMF），通过网络数据库搜索、比对，有2个蛋白质点被鉴定，分别是与植物抗病性或代谢相关的蛋白质，即磷酸核酮糖激酶（Phosphoribulokinase，PRK）和脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbatereductase，DHAR），表明这2个蛋白质在小麦与条锈病菌的互作过程中起到了重要的作用［27］。

国际上对于利用蛋白质组学研究植物病理相关问题的学者也较多。Marra利用蛋白质组学研究技术的高效率、高通量的优势，研究植物、病原菌和拮抗型木霉菌三者之间相互作用前后的蛋白质表达变化情况，对植物的抗病机制和拮抗木霉菌的拮抗机理进行了系统的研究［28］。该研究结果也为从系统上解析植物与病原微生物相互作用的机制提供了很好的参考研究模式。

2004年，Kim等使用双向电泳研究技术及其他的一些蛋白质组分离和鉴定手段，研究了水稻细胞和稻瘟病菌悬浮培养时，系统蛋白质的表达变化情况，并分别于悬浮培养后24、48h提取总蛋白质，通过双向电泳分离，并对来自6个不同基因的12种蛋白质进行了质谱鉴定，其中由稻瘟病菌诱导产生了类黄酮还原酶类蛋白和水稻病原菌相关蛋白10（Ricepathogenrelatedproteinclass10，PR－10）［29］。此后，Kim等又对接种有毒力和无毒力稻瘟病菌的水稻叶片进行了蛋白质组学研究，结果表明，在接种后的水稻叶片中，有8个蛋白质因稻瘟病菌的侵染诱导表达或表达增强，随后通过质谱技术分别鉴定了这8个诱导表达或表达量上升的蛋白质，分别是TLP、Glu1、PBZ1、PR－10、POX22．3、Glu3和2个RLK（receptor－likeproteinkinase）［30］。

与Kim等2004年的研究方法类似，Ndimba等和Chivasa等分别对拟南芥悬浮细胞在病原真菌（Fusarium）细胞壁分泌物诱导下的蛋白质表达变化情况，研究表明，在病原真菌细胞壁分泌物的诱导作用下，悬浮细胞外和细胞内的蛋白质表达变化差异显著，该研究系统探讨了拟南芥对病原菌侵染的抗病相关蛋白质的表达，以及与信号转导途径相关基因的表达变化［31－32］。Konishi等应用蛋白质组学研究方法，分别提取、分离和鉴定了受稻瘟病菌侵染后的水稻叶片中具有显著差异表达的蛋白质，发现蛋白质PR－5在病原菌侵染12h后被诱导表达，分析表明该蛋白的表达可能与寄主非专化性抗性反应相关［33］。Oh等对拟南芥悬浮细胞病原真菌互作过程进行了系统研究，结果表明，脂肪酶类分泌蛋白GLIP1的诱导表达与拟南芥的抗病性密切相关，研究分析认为，GLIP1蛋白可能是通过抑制病原真菌的分生孢子的活力使得拟南芥获得对病原真菌的抗病性［34］。Andrade等应用差异蛋白质组学方法，从花椰菜与黑腐病致病菌（Xanthomonascampestrispv．campestris）相互作用前后系统蛋白质表达模式的变化情况，对在拉丁美洲危害严重的黑腐病的发病机制进行了系统研究，结果表明分别有6个来自寄主植物和15个来自病原菌的差异表达蛋白质点被鉴定，这些与病程相关的蛋白质点的鉴定对于深入了解黑腐病发病分子机理及其在植物抗病育种上的应用奠定了基础［35］。

Trudy等用TCA沉淀法提取了马铃薯晚疫病菌Phytophthorainfestans菌丝培养液中的总蛋白质，经双向电泳分离后进行质谱鉴定，结果表明，有9个细胞外分泌蛋白的质谱鉴定结果与cDNAs所编码蛋白质的推测质谱数据相吻合［36］。该研究将蛋白质组学与基因组学的研究有机结合、相互验证，为后续相关的研究提供了新的思路。

很显然，应用蛋白质组学从生物体与病原物互作的系统水平研究病原菌与寄主植物相互作用的蛋白质表达变化用于植物病理学的研究具有很强的优势。这提供了一个直接研究植物病害系统的平台，通过对抗病品种和感病品种在病原菌胁迫下的蛋白质组数据进行对比分析，就可以从这个研究平台上直接的找出一些特异的病程相关蛋白质，并通过其他的分子生物学方法对其进行标记、鉴定和功能的预测分析，再将这些记与植物的抗病育种相结合，从而更好地为农业生产服务。

2．2蛋白质组学在植物病理学上应用的不足之处

随着功能基因组学与现代分子生物学研究方法的不断更新、完善和发展，蛋白质组研究技术的日益进步，以及大量的模式物种与病原物间相互作用研究体系的建立，许多与病原菌的致病性相关或与寄主的抗病反应相关的基因和蛋白质的功能和作用机理得到了很好的解释，这些研究结果也为全面了解植物抗病的分子机制及其在生产实践中的应用打下了基础。然而，蛋白质组学作为后基因组时代新兴交叉学科，当前还存在一些技术上的缺陷与不足尚待改进和完善。许多研究结果表明，在寄主植物－病原菌互作的过程中，一些小分子或者低丰度的蛋白质往往起到信号识别、传导、传递以及激活下游信号发生级联反应的关键作用。而在蛋白质组学分析过程中，受到蛋白质提取方法的限制，有较多低丰度蛋白质得不到相应的分离和鉴定。另一方面，有许多低丰度表达或低分子量蛋白点虽然具备显著差异表达特征，但却未得到成功鉴定，无法获得该类蛋白质点的相关结构及功能信息，而这些蛋白质却往往在互作过程中起到较为关键的作用。

除此之外，蛋白质的分离技术对于整个蛋白质组学的研究起到决定性的作用，在植物组织中，仍有许多的蛋白质如非水溶性蛋白质的提取成为是我们获得整个系统的蛋白质组的制约因素。因此，由于生物质谱技术的高度灵敏性，在蛋白质的提取和分离过程中，蛋白质的纯化与否严重影响了蛋白质组研究技术在植物病理学科尤其是植物与病原物互作的相关研究。此外，蛋白质的提取、分离技术还有待于进一步的提高和完善。蛋白质组学研究与功能基因组学密息息相关，目前，蛋白质组学的研究领域还相对狭窄，除人类医学领域外，蛋白质组学分析技术仅在拟南芥、水稻等少数完成基因组序列分析的模式生物中得到了较为广泛的应用，而对于其他生物尚处于起步阶段。因此，基因组数据库的不完整也成为限制蛋白质组学研究的瓶颈之一，迫切需要各类重要物种基因组数据库的不断补充和完善来扩充该学科的应用范围。

对于蛋白质的分离技术而言，虽然双向电泳具有不可替代的优势，但是其规模化有待于进一步加强，二维凝胶电泳染色转移等环节操作困难费时，又有操作中分离容量的先天限制，再加上极酸、极碱、低丰度、非水溶性等蛋白质均难以呈现，样品中高盐离子浓度、蛋白质的定量等以及高质量蛋白质的制备等方面都有待于进一步的提高和完善。蛋白质的生物信息学研究，虽然已有一定范围的应用，也仍困难重重。因此，国际上开始重视研究以酵母双杂交技术和色谱－电泳－质谱为主的技术平台，用于研究蛋白质连锁群和蛋白质功能网络系统，但受限于其操作的复杂性，仍缺乏快速、高效、高通量的技术手段获取复杂蛋白质相互作用的多维信息。

3结语与展望

越来越多的新技术、新方法将会随着现代分子生物学实验技术的不断完善、发展而涌现，这些新技术应用于与植物病害相关的研究系统中将为植物病理学的发展提供更加优越的条件和研究渠道。目前借助于成熟的蛋白质组学分析方法和生物质谱鉴定技术，在寄主植物与病原菌包括病原真菌和病原细菌2类互作系统中，从植物寄主上获得了大量的由病原物的诱导产生的差异表达蛋白质。在前人研究的各类互作系统中，已充分验证了部分以病程相关蛋白家族为主的蛋白质的功能，也明确了这些蛋白在植物抗病机制中的具体功能，这些研究结果将为基因组学和转录组学的研究提供了理论依据，为更深入解析植物寄主响应病原菌侵染的复杂分子机制提供了有力证据。

在病原菌接触并侵入寄主植物后，寄主与病原菌之间的相互作用是一个复杂的动态过程。从基因组水平无法对这一动态过程进行清晰的描述和解析，DNA序列信息对蛋白质序列的预测也不是绝对意义上的，因为它不能说明蛋白质的翻译后加工、修饰等，而蛋白质组学的研究对象即为基因功能的执行者———蛋白质，只有蛋白质组学的相关研究才能更直观地掌握病原菌与寄主的复杂动态互作过程。因此，只有将蛋白质组学研究技术与基因组学的研究成果有机结合、相互验证，才能更全面、深入地解释植物与病原菌互作的机制，从而更好地为农业生产服务。

由于生物体在受到其他生物或非生物胁迫后其机体的蛋白质组是一个动态、变化的系统，其复杂性远远大于基因组。为解释植物与病原菌互作中蕴含的生物机理，更深入研究其分子机制，仍需要在蛋白质表达模式和功能以及基因调控机理等方面做大量的研究工作，在不断更新、完善和发展现有研究技术手段的同时，还需不断扩展蛋白质组学与其他学科领域研究成果的相互交流，开发新的研究方案、不断更新和完善蛋白质数据库系统，加强相关领域研究者之间的学术交流与合作，以利于人类更深入、全面的认识植物与病原菌互作的复杂分子机制。