RNA检验法对法医学的作用范文

本文作者：李中红洪一兰李红霞刘秋英单位：广州市公安局刑事技术所中山大学附属第五医院广东珠海暨南大学生物医药研究开发基地广东广州

随着分子生物学技术方法的成熟与发展，DNA分析技术已经在法医学中得到广泛应用，但RNA技术的应用还处于起步阶段。法医学中采用RNA分析判断死亡间隔时间的第一篇文献在1984年发表，随后也只有一些零散的报导，直到上个世纪末期，RT-PCR技术的发展促使了RNA在体液分析中的应用和伤口愈合中分子变化的研究。最近几年RNA技术在法医病理分子生物学中的研究及应用越来越多，国际期刊有关RNA技术在法医学研究中的文章逐步增加，但我国有关RNA技术在法医病理学中研究的报道甚少。本文综述了近年的研究中，RNA技术在法医病理学中的应用研究的几个方面。

1死亡后RNA稳定性

人死亡后RNA将被核糖核酸酶所降解，物理的和化学的因素还会加速这个降解的过程。在核糖核酸酶富集的器官（如胰腺和肝脏等）RNA断裂降解的速度较快，而在其他组织（如大脑等）则在死亡后RNA降解很慢，间隔96h后RNA还比较稳定。在胎儿和新生的肺组织、人骨头和血液中死亡后的RNA的稳定时间也比较长。针对人体的研究表明，尽管在死亡后总RNA已经有所降解，但在死亡间隔时间超过96h的样品中提取的mRNA适用于进行RT-PCR检测。研究已证实在大鼠的脑组织中可以获得最稳定的mRNA，而在肝脏组织中RNA的降解最严重[4]。尽管一些研究认为死亡后大脑组织中的RNA降解不多，但死亡前的昏迷或窒息等痛苦因素也会影响死亡后人脑中的RNA的稳定性。在另一方面，如果死亡前的痛苦因素确实影响到死亡后mRNA完整性和/或死亡前基因表达的话，那么通过mRNA分析可以判断死亡前的痛苦因素，鉴别死亡前的痛苦类型和持续时间，昏迷的时间及程度等，这些对于分析死亡信息很有用[5]。

2体液类型的鉴定

DNA分析可以从一个小污点痕迹中取得一些细胞就可以进行，但是无法鉴定到这个细胞的来源，例如收集到体液可以进行个体鉴别，但PCR分析有时无法鉴定是某种体液。因为在不同的体液中细胞和组织功能不一样，mRNA表达水平不一样，所以通过检测mRNA的表达可以对体液类型进行鉴别[6-8]。基质金属蛋白酶-11是一种能降解细胞外基质的水解蛋白酶，该酶在月经血中表达的特异性高，因此通过检测基质金属蛋白酶-11的mRNA的表达，可以成为对月经血区别于其他血液的标志物[9]。痕量血迹已成为重要的证据类别，月经血的鉴定是重要的体液检测[10]。一般的血液中则是β-膜收缩蛋白（β-Spectrin，SPTB）、胆色素原脱氨酶（Porphobilinogen-Deami-nase，PBGD）和α-血红蛋白1（Hemoglobinalphalocus1,HBA）表达高。另外，精液和唾液等体液的特异性标志物的研究发现也会对法医鉴定具有重要的意义。唾液中富酪蛋白（Statherin，STATH）的表达较高。精蛋白1(Protamine1，PRM1)、精蛋白2(Protamine2，PRM2)、激肽释放酶3(Kallikrein3，KLK=PSA)是精液的特异性标志物。人β防御素1(Humanbeta-defensin1，HBD-1)和粘液素4(Mucin4)。

3损伤时间的鉴定

法医学中通常需要对一种内伤或外伤的受伤时间进行鉴定，包括推断受伤先后顺序，损伤发生在死亡前还是死亡后，受伤与死亡的时间间隔，伤害是否是导致死亡的原因等。近年的研究发现可通过研究受伤害部位及其附近组织的分子变化可以解决这些问题，主要研究焦点就是通过RNA技术进行鉴定[5,11]。在细胞功能进行改变的时候总包括有基因表达的变化，一种新蛋白的合成或者某一种蛋白浓度的增加首先需要该蛋白的基因进行转录和翻译，也就是需要集聚大量的mRNA与核糖体相结合，所以mRNA水平显著提高。总而言之，在受伤后细胞中某一种蛋白合成的改变首先就是该蛋白mRNA合成水平的改变，因此，在法医病理学中，可以通过对某蛋白的mRNA进行定量分析，得知该蛋白表达的变化。当然，这当中关键的还是损伤的检测标志物的确定，至今为止，仅有少数的动物组织中发现一些分析受伤时间的标志物，研究发现脑部受伤后bFGF在受伤后48h达到表达的峰值，受伤后1h白介素10的表达达到峰值[12]，随着研究的深入，将来可以发现受伤后一系列细胞因子表达的变化，并可以找到合适的标志物进行检测，以确定受伤时间。Ikematsu等[13]研究发现在颈部被掐或在机械外力重伤死亡后30min内，通过荧光差异PCR发现了一系列的基因表达发生了改变。

4死亡间隔时间的确定

一些研究者提出了采用核酸降解的程度来检测死亡间隔时间[14]，某些基因RNA的降解程度与死亡间隔时间呈现一定的规律，通过RNA降解程度或者RT-PCR检测可以推断死亡间隔时间。一些研究发现在一定的环境条件下，死亡后24-48h内，尸体的RNA还保持很好的完整性。刘良等[15]研究发现大鼠死后管家基因GAPDH、β-actinmRNA具有一定的稳定性，大鼠死后不同组织、不同管家基因mRNA的稳定性(即检测时限)不同：对于GAPDH，脑为7d、肝为48h、脾为32h、肾为40h；对于β-actin，脑为8d、肝为72h、脾为40h、肾为48h。与GAPDHmRNA相比，β-actinmRNA更不易降解。采用一步法荧光标记RT-PCR技术检测大鼠死后不同组织(脑、肝、脾、肾)管家基因GAPDH及β-actinmRNA的降解规律，可为死亡间隔时间的推断研究提供一种新的、客观、有效的观测指标，可为常规死亡间隔时间推断方法的补充。因此，通过检测RNA的降解提供有关RNA在组织中的完整性等信息，可以应用于受伤时间或者死亡时间等的判断。

5痕量血液的残留时间鉴别

采用基于RT-PCR技术的特殊的多重RT-PCR和竞争RT-PCR技术等，Bauer等[6]和Anderson等[16]从干燥的血液痕迹中取材检测了RNA降解参数，对材料的残留时间进行判断。即使材料完全干燥了，但是体外的RNA降解过程仍然继续，同时这个过程也是很缓慢并且有很多变数的。随着技术的发展，将来通过采用实时定量PCR和芯片扫描技术可以提供更灵敏的方法进行鉴定。

6死亡瞬间细胞或器官功能状态的检测

法医学的重要研究就是死亡原因的鉴定，在瞬间死亡的过程中细胞和器官的功能改变比疾病发生过程中的改变要快速。然而，很多死亡并不会产生形态学的改变，因为可能这些改变并没有持续很久，没有时间使机体产生可视的变化。另一方面，细胞功能的变化首先表现在mRNA模式--分析这个死亡后样品可以为分析导致死亡的病理学机制，mRNA可以快速地在几分钟内上调，可以在紧急发生的时间得到检测。

最近对红细胞生成素、血管内皮生长因子、缺氧诱导因子1的mRNA转录水平的研究发现，这些因子受到供氧的调控[17,18]，因此检测这些因子的mRNA水平的定量分析可以反应死亡时的供氧情况。理论上，采用芯片扫描技术，可以一次实验分析得到多种基因表达水平的结果，从而有利于对死亡原因进行深入的分析。分子改变例如可诱导NO的含量增加在脑组织中伴随着急性酒精中毒，这有助于判断死亡原因。受到压力冲击导致的分子变化前面已经描述过了。神经受伤促使了FE65（一种β淀粉前体蛋白结合蛋白）等一些分子标志物的改变[19]，如果是受到外物的击伤，则在肺组织中一些细胞因子的表达会发生改变。

在法医学领域中，对于死亡后组织中RNA变化的应用研究刚起步，但目前的科研发展和研究进展来看，在这方面的应用将是不久将来的事情。随着分子生物学技术方法的发展与成熟，RNA技术在法医学中的应用也将逐步完善和推广。