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鹅细小病毒感染雏鹅研究

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禽类MHC对细胞之间的相互作用进行免疫调节,其结构与疾病防控研究密切相关[1]。MHC是编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因群,存在高度多态性,能适应和抵抗大部分病原微生物[2]。病原体驱动的选择是有利于MHC杂合子,表明MHC基因型和与宿主的抗病性或免疫应答水平密切相关。MHCⅠ类等位基因与诸多疾病有关,并且复杂性和多态性使个体间的免疫应答有所不同[3]。目前主要研究鸡和鸭的MHC,而鹅的MHC研究较少,鹅的MHCⅠ存在高度多态性[4],MHCIIβ片段来自不同的MHCIIB基因座[5],MHC基因间存在着复杂的功能及协同互作,为此本试验分析GPV感染雏鹅的MHC多态性变异,以期为进一步研究鹅的易感性及抗病机理奠定基础。

1材料与方法

1.1试验动物随机选取生长一致、健康的3日龄雏鹅,由青岛农业大学莱阳五龙鹅实验基地提供。

1.2试验方法

1.2.1雏鹅处理将种毒GPVYZ经口腔接种6日龄的雏鹅,每只接种0.2mL,感染组雏鹅(YZ)。同时对照组雏鹅(CK)接种等量的生理盐水,连续观察发病症状,分别采集肝脏。

1.2.2制备细胞悬液参照文献[6]的方法,收集鹅肝脏细胞膜。

1.2.3膜蛋白的提取参照文献[7]的方法,用TritonX-100抽提膜蛋白,丙酮沉淀,PEG6000浓缩,冷冻真空干燥粗膜蛋白。

1.2.4MHC的分离纯化PBS溶解粗蛋白样品,上样于经同样缓冲液平衡的SephadexG-200柱脱盐,梯度(0~0.6mol/LNaCl,PBS0.02mol/L)洗脱,收集合并活性蛋白部分,再上样于预先用pH值6.3100mmol/LPBS平衡的BioGelP-100凝胶柱纯化,用PBS(pH值6.3,100mmol)洗脱,收集纯化的MHC,冷冻真空干燥。

1.2.5蛋白质含量检测总蛋白含量,参照文献[8],以BSA为标准,紫外法检测,总蛋白含量(mg/mL)=1.55×A280-0.76×A260,系数F1=1.115,系数F2=0.76;MHC的含量,参照鹅MHCⅠ/Ⅱ酶联免疫分析试剂盒(上海沪鼎生物科技公司LOT10-45-618)进行测定,λ=450nm。

1.2.6SDS-PAGE参照文献[9],分离胶10%,12.5%,浓缩胶2.5%,室温下25mA恒流,电泳6~7h。标准蛋白:MBISM0431。

1.2.7凝胶染色用0.12%CBBR250,乙醇-乙酸(25%~8%)溶液染色,乙醇-乙酸(20%~7%)溶液脱色,透射光下成像记录。

1.2.8数据分析用QuantityOne/BandScan5.0软件扫描、标记SDS-PAGE凝胶条带。

2结果与分析

2.1MHC的分离纯化从图1可知,粗提MHC经柱层析分离纯化,得到4个洗脱吸收峰:CKp1,YZp1,CKp2,YZp2。

2.2MHC的含量与比活力由图2可知,粗提MHC的CK组含量是YZ组的1.2倍,均有MHCⅠ、MHCⅡ,比活力变化不明显。纯化的MHC,CK组与YZ组的二个蛋白峰含量相差3.6~4倍,CKp2,YZp2与CKp1,YZp1相差1~2倍,YZ组明显降低。P2与P1的MHCⅠ/Ⅱ比活力差达65~79倍,P2是MHCⅠ/Ⅱ。YZ组MHC的比活力是CK组的86%~52%。

2.3粗提MHC的SDS-PAGE由图5显示,在非还原条件下,初级MHC的CK0和YZ0,均出现11条相同蛋白带谱,蛋白主带区为30~90ku、35ku、20ku,而肝脏蛋白CK和YZ也类似的显示出13、12条蛋白带。在还原条件下,初级MHC的CK0和YZ0分别出现了9、10条蛋白带,肝脏蛋白CK和YZ也分别显示出13、9条蛋白带。CK0与YZ0相比较,大于100ku的为1∶0,100~45ku的为4∶5,小于45ku的是4∶5,并且YZ0明显缺失84ku、61ku蛋白带,主带峰灰度值也明显低于CK0。

2.4纯化MHC的SDS-PAGE由图4显示,纯化MHCⅠ/Ⅱ的特征带是30ku,33ku,40ku,42ku低分子量蛋白。与CKp2相比,YZp2明显缺失45ku蛋白带,新增加34ku蛋白带;而YZp1明显缺失42ku蛋白带,新增38ku蛋白带。

3讨论

MHC是一类细胞表面的转膜蛋白,通过结合和向T细胞抗原特异性受体呈递抗原片段发挥功能,与免疫反应和抗病性密切相关。本试验研究显示,粗提MHC的比活力达到较平稳水平,纯化MHC蛋白峰2与蛋白峰1的MHCⅠ/Ⅱ比活力差异明显(65~79倍),YZ组的分离和纯化MHC含量与比活力明显低于CK组。表明GPV感染对鹅肝脏MHC基因表达产生了一定抑制作用,影响着雏鹅的免疫反应调控和生理调节功效,促使病毒感染雏鹅。

MHC基因是一组紧密连锁高度多态性的染色体基因群,MHC类分子的重链/α与轻链/β以非共价键结合,在细胞膜外折叠产生功能域,决定着他们的多态性,尤其是MHC分子中肽结合区,是多态性最高的区段,与抗原肽之间的亲和力密切关联抗病性/易感性。鹅MHC类分子等位基因之间的变异主要集中于α区,存在14个氨基酸高置换位点。本试验研究显示,粗分离MHC出现了11条基本的蛋白带谱,蛋白主带区为30~90ku、35ku、20ku,与MHC类蛋白分子相一致,YZ0明显缺失84ku、61ku蛋白主带。提示GPV感染使雏鹅肝脏MHC的构成发生明显的变化,影响着各组分间的相互协作及对外源病原微生物侵袭的抵御力,因此MHC的多态性和抗病作用是疾病研究中的最佳候选标记基因。而纯化的MHC是30ku,33ku,40ku,42ku的低分子量特征蛋白,与重链/α(44kD/33kD)和轻链/β(12kD/29kD)相一致。YZ组明显缺失45ku蛋白峰p2和42ku蛋白峰p1特征带,新增加34ku蛋白峰p2和38ku蛋白峰p1带;提示GPV的感染影响着雏鹅肝脏MHC基因的表达,使MHC分子产生较大变异,45ku、34kuMHC是GPV感染的敏感蛋白,42ku、38ku蛋白带也与GPV的感染密切相关,因此,MHC抗原在起受体作用时,会与病原体结合,易为GPV感染,成为GPV的易感基因。

作者:朱新产 毕经帅 杨丽金 单位:青岛农业大学生命科学学院 山东省高校植物生物技术重点实验室

鹅细小病毒感染雏鹅研究责任编辑:杨雪    阅读:人次