鹅细小病毒感染雏鹅研究范文

禽类MHC对细胞之间的相互作用进行免疫调节，其结构与疾病防控研究密切相关[1]。MHC是编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因群，存在高度多态性，能适应和抵抗大部分病原微生物[2]。病原体驱动的选择是有利于MHC杂合子，表明MHC基因型和与宿主的抗病性或免疫应答水平密切相关。MHCⅠ类等位基因与诸多疾病有关，并且复杂性和多态性使个体间的免疫应答有所不同[3]。目前主要研究鸡和鸭的MHC，而鹅的MHC研究较少，鹅的MHCⅠ存在高度多态性[4]，MHCIIβ片段来自不同的MHCIIB基因座[5]，MHC基因间存在着复杂的功能及协同互作，为此本试验分析GPV感染雏鹅的MHC多态性变异，以期为进一步研究鹅的易感性及抗病机理奠定基础。

1材料与方法

1.1试验动物随机选取生长一致、健康的3日龄雏鹅，由青岛农业大学莱阳五龙鹅实验基地提供。

1.2试验方法

1.2.1雏鹅处理将种毒GPVYZ经口腔接种6日龄的雏鹅，每只接种0.2mL，感染组雏鹅（YZ）。同时对照组雏鹅（CK）接种等量的生理盐水，连续观察发病症状，分别采集肝脏。

1.2.2制备细胞悬液参照文献[6]的方法，收集鹅肝脏细胞膜。

1.2.3膜蛋白的提取参照文献[7]的方法，用TritonX-100抽提膜蛋白，丙酮沉淀，PEG6000浓缩，冷冻真空干燥粗膜蛋白。

1.2.4MHC的分离纯化PBS溶解粗蛋白样品，上样于经同样缓冲液平衡的SephadexG-200柱脱盐，梯度（0～0.6mol/LNaCl，PBS0.02mol/L）洗脱，收集合并活性蛋白部分，再上样于预先用pH值6.3100mmol/LPBS平衡的BioGelP-100凝胶柱纯化，用PBS（pH值6.3，100mmol）洗脱，收集纯化的MHC，冷冻真空干燥。

1.2.5蛋白质含量检测总蛋白含量，参照文献[8]，以BSA为标准，紫外法检测，总蛋白含量（mg/mL）=1.55×A280-0.76×A260，系数F1=1.115，系数F2=0.76；MHC的含量，参照鹅MHCⅠ/Ⅱ酶联免疫分析试剂盒（上海沪鼎生物科技公司LOT10-45-618）进行测定，λ=450nm。

1.2.6SDS-PAGE参照文献[9]，分离胶10%，12.5%，浓缩胶2.5%，室温下25mA恒流，电泳6～7h。标准蛋白：MBISM0431。

1.2.7凝胶染色用0.12%CBBR250，乙醇-乙酸（25%～8%）溶液染色，乙醇-乙酸（20%～7%）溶液脱色，透射光下成像记录。

1.2.8数据分析用QuantityOne/BandScan5.0软件扫描、标记SDS-PAGE凝胶条带。

2结果与分析

2.1MHC的分离纯化从图1可知，粗提MHC经柱层析分离纯化，得到4个洗脱吸收峰:CKp1，YZp1，CKp2，YZp2。

2.2MHC的含量与比活力由图2可知，粗提MHC的CK组含量是YZ组的1.2倍，均有MHCⅠ、MHCⅡ，比活力变化不明显。纯化的MHC，CK组与YZ组的二个蛋白峰含量相差3.6～4倍，CKp2，YZp2与CKp1，YZp1相差1～2倍，YZ组明显降低。P2与P1的MHCⅠ/Ⅱ比活力差达65～79倍，P2是MHCⅠ/Ⅱ。YZ组MHC的比活力是CK组的86%～52%。

2.3粗提MHC的SDS-PAGE由图5显示，在非还原条件下，初级MHC的CK0和YZ0，均出现11条相同蛋白带谱，蛋白主带区为30～90ku、35ku、20ku，而肝脏蛋白CK和YZ也类似的显示出13、12条蛋白带。在还原条件下，初级MHC的CK0和YZ0分别出现了9、10条蛋白带，肝脏蛋白CK和YZ也分别显示出13、9条蛋白带。CK0与YZ0相比较，大于100ku的为1∶0，100～45ku的为4∶5，小于45ku的是4∶5，并且YZ0明显缺失84ku、61ku蛋白带，主带峰灰度值也明显低于CK0。

2.4纯化MHC的SDS-PAGE由图4显示，纯化MHCⅠ/Ⅱ的特征带是30ku，33ku，40ku，42ku低分子量蛋白。与CKp2相比，YZp2明显缺失45ku蛋白带，新增加34ku蛋白带；而YZp1明显缺失42ku蛋白带，新增38ku蛋白带。

3讨论

MHC是一类细胞表面的转膜蛋白，通过结合和向T细胞抗原特异性受体呈递抗原片段发挥功能，与免疫反应和抗病性密切相关。本试验研究显示，粗提MHC的比活力达到较平稳水平，纯化MHC蛋白峰2与蛋白峰1的MHCⅠ/Ⅱ比活力差异明显（65～79倍），YZ组的分离和纯化MHC含量与比活力明显低于CK组。表明GPV感染对鹅肝脏MHC基因表达产生了一定抑制作用，影响着雏鹅的免疫反应调控和生理调节功效，促使病毒感染雏鹅。

MHC基因是一组紧密连锁高度多态性的染色体基因群，MHC类分子的重链/α与轻链/β以非共价键结合，在细胞膜外折叠产生功能域，决定着他们的多态性，尤其是MHC分子中肽结合区，是多态性最高的区段，与抗原肽之间的亲和力密切关联抗病性/易感性。鹅MHC类分子等位基因之间的变异主要集中于α区，存在14个氨基酸高置换位点。本试验研究显示，粗分离MHC出现了11条基本的蛋白带谱，蛋白主带区为30～90ku、35ku、20ku，与MHC类蛋白分子相一致，YZ0明显缺失84ku、61ku蛋白主带。提示GPV感染使雏鹅肝脏MHC的构成发生明显的变化，影响着各组分间的相互协作及对外源病原微生物侵袭的抵御力，因此MHC的多态性和抗病作用是疾病研究中的最佳候选标记基因。而纯化的MHC是30ku，33ku，40ku，42ku的低分子量特征蛋白，与重链/α（44kD/33kD）和轻链/β（12kD/29kD）相一致。YZ组明显缺失45ku蛋白峰p2和42ku蛋白峰p1特征带，新增加34ku蛋白峰p2和38ku蛋白峰p1带；提示GPV的感染影响着雏鹅肝脏MHC基因的表达，使MHC分子产生较大变异，45ku、34kuMHC是GPV感染的敏感蛋白，42ku、38ku蛋白带也与GPV的感染密切相关，因此，MHC抗原在起受体作用时,会与病原体结合,易为GPV感染，成为GPV的易感基因。

作者：朱新产 毕经帅 杨丽金 单位：青岛农业大学生命科学学院 山东省高校植物生物技术重点实验室