槲皮素对宫颈癌细胞增殖的影响范文

【摘要】目的：探讨槲皮素对于人宫颈癌细胞SiHa的作用及机制。方法：用不同浓度的槲皮素（0、20、40和80μmol/L）处理SiHa细胞不同时间后（24h，48h和72h），通过噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力的变化；通过流式细胞仪检测槲皮素对细胞周期的影响；通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法（Westernblotting）检测槲皮素对细胞周期蛋白D1（CyclinD1）表达的影响。结果：MTT法检测结果显示，槲皮素处理SiHa细胞24h和48h后，40μmol/L和80μmol/L组的细胞活力低于对照组（P＜0.05）；槲皮素处理SiHa细胞72h后，20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L组的细胞活力低于对照组（P＜0.05）；在40μmol/L和80μmol/L组，随着培养时间延长，细胞活力较24h时降低（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果显示，SiHa细胞经过20、40和80μmol/L浓度的槲皮素分别处理48h后，处于G0/G1期的细胞百分比明显高于对照组。RT-PCR和Westernblotting结果显示，槲皮素可以下调SiHa细胞中CyclinD1蛋白的表达。结论：槲皮素通过下调SiHa细胞中CyclinD1蛋白的表达，可以抑制SiHa细胞的活力和增殖。

【关键词】槲皮素；宫颈肿瘤；细胞周期蛋白D1；细胞增殖

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内，宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，高居女性恶性肿瘤的第2位，而世界每年宫颈癌的新发病例为50多万人，因罹患宫颈癌而死亡的病人有20多万，是一种严重危害女性健康的恶性疾病[1]。槲皮素（quercetin，Que）广泛分布于植物的果实、叶子以及花中，是一种天然的多羟基黄酮类化合物，具有很高的药用价值，研究表明槲皮素具有多种药理活性，包括抗炎症、抗氧化、抗病毒、调节血脂、降血压及保护心肌缺血再灌注等作用。目前研究表明，槲皮素不仅可以抑制多种肿瘤细胞的增殖，还可以降低肿瘤细胞迁移和侵袭的能力，在多种恶性肿瘤具有抗肿瘤的生物学作用[2]。但是，槲皮素对人宫颈癌SiHa细胞增殖的影响目前还不清楚。因此，本研究通过使用槲皮素处理人宫颈癌SiHa细胞，研究槲皮素对人宫颈癌SiHa细胞的影响，并初步探讨槲皮素在SiHa细胞中的作用机制，从而为槲皮素的临床应用提供相关的实验基础。

1材料与方法

1.1材料

人宫颈癌SiHa细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。槲皮素购于美国Sigma公司，DMEM培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于浙江天杭生物科技股份有限公司，细胞周期蛋白D1鼠单克隆抗体和β-actin鼠单克隆抗体均购于美国SantaCruz公司，二甲基亚砜（DMSO）购于美国Sigma公司，噻唑蓝（MTT）试剂购于美国Sigma公司，RNA提取试剂Trizol购于美国Invitrogen公司，一步法逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒、琼脂糖购于美国TaKaRa公司，其余为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1细胞培养

人宫颈癌SiHa细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于含5%CO2的37℃孵箱中进行常规培养，每3～4d用胰酶消化，传代1次。

1.2.2槲皮素的配置与实验分组

将槲皮素溶解于DMSO中配置成储存母液，于-20℃冰箱保存。在进行实验时，用DMEM培养基分别进行稀释，DMSO的最终浓度＜0.1%。对数生长期的人宫颈癌SiHa细胞分为对照组（DMEM培养基+DMSO，槲皮素浓度为0μmol/L）和实验组（槲皮素浓度分别为20、40和80μmol/L）。

1.2.3MTT法检测细胞活力

将处于对数生长期的人宫颈癌SiHa细胞通过胰酶消化后，制成单细胞悬液，以3×104的细胞浓度接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL的DMEM培养基。次日，待细胞贴壁后,更换为含有不同浓度槲皮素的DMEM培养基进行培养（槲皮素浓度分别为0、20、40和80μmol/L），分别培养24、48、72h后，吸弃各孔内的培养基，分别加入100μL的MTT（5g/L），37℃孵育4h后吸弃各孔中的上清液，分别加入150μLDMSO，于摇床震荡10min后，用酶标仪测定490nm波长处每孔的光密度值（OD），每组均设置3个复孔。细胞活力的计算公式：细胞活力（%）＝（槲皮素组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期

将处于对数生长期的人宫颈癌SiHa细胞通过胰酶消化后，接种于6孔细胞培养板中，次日待细胞贴壁后,更换为含有不同浓度槲皮素的DMEM培养基（槲皮素浓度分别为0、20、40和80μmol/L），继续培养48h后，通过胰酶常规消化并收集各组细胞，1000r/min离心5min后，吸弃上清液，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次后，加入预冷的70%的乙醇，于4℃冰箱固定细胞12h，之后1000r/min离心5min，PBS洗涤细胞2次，用含0.01%核糖核酸酶（RNase）的碘化丙啶（PI）染液处理细胞后，避光染色30min后，使用流式细胞仪进行检测，通过CellQuest软件分析结果，每组均设置3个复孔。

1.2.5RT-PCR将处于对数生长期的人宫颈癌

SiHa细胞通过胰酶消化后，接种于6孔细胞培养板中，次日待细胞贴壁后，更换为含有不同浓度槲皮素的DMEM培养基（槲皮素浓度分别为0、20、40和80μmol/L），继续培养48h后收集各组细胞，按照RNA提取试剂盒提取总RNA，以CyclinD1引物进行RT-PCR检测，上游5′-GAACACCAGCTCCTGTGCT－GCG-3′；下游5′-TGTCCACGTCCCGCACGTT-3′；扩增产物大小为880bp。

1.2.6蛋白质印迹法（Westernblotting）

将处于对数生长期的人宫颈癌SiHa细胞通过胰酶消化后，接种于6孔细胞培养板中，次日待细胞贴壁后,更换为含有不同浓度槲皮素的DMEM培养基（槲皮素浓度分别为0、20、40和80μmol/L），继续培养48h后收集各组细胞，分别加入细胞裂解液收集细胞蛋白，并测定各组细胞的蛋白浓度。将蛋白样本与蛋白质分子质量标准分别上样于加样孔，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白。电泳结束后，进行转膜，转膜结束后，将膜移至含5%的脱脂奶粉的Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液（TBST）中室温封闭1h，用TBST洗膜10min×4次。加入一抗，4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜10min×4次，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h，TBST洗膜10min×4次，然后用化学发光检测液进行发光反应，于暗室中曝光。

1.3统计学方法

采用SPSS12.0软件进行统计学分析。定量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用析因设计的方差分析和单因素方差分析，2组样本间的均数比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1槲皮素对人宫颈癌细胞SiHa的细胞活力影响

MTT法检测结果显示，槲皮素处理SiHa细胞24h和48h后，40μmol/L和80μmol/L组的细胞活力低于对照组，槲皮素处理SiHa细胞72h后，20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L组的细胞活力低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；在40μmol/L和80μmol/L组，随着培养时间延长，细胞活力较24h时降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2槲皮素对SiHa细胞细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果显示，SiHa细胞经过20、40和80μmol/L浓度的槲皮素分别处理48h后，处于G0/G1期细胞的百分比分别为（58.46±1.58）%、（64.92±1.15）%和（71.50±1.18）%，与对照组（52.24±1.46）%相比均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。此外，SiHa细胞经过20、40和80μmol/L浓度的槲皮素分别处理48h后，处于S期细胞的百分比分别为（35.48±0.91）%、（26.53±1.93）%和（21.96±0.33）%，与对照组（41.63±2.11）%相比均减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3槲皮素对SiHa细胞中CyclinD1蛋白表达的影响

RT-PCR和Westernblotting结果显示，在使用不同浓度的槲皮素处理SiHa细胞48h后（槲皮素浓度分别为20、40和80μmol/L），SiHa细胞中CyclinD1在转录水平以及蛋白水平的表达均出现了不同程度的下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3讨论

槲皮素是一种广泛分布于植物的果实、叶子以及花中的多羟基黄酮类化合物，目前在100多种中草药中均可以检测到槲皮素的存在，其主要的生物学功能包括抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎症以及保护心血管等。研究表明，槲皮素对于多种恶性肿瘤细胞具有抑制作用[3]。在乳腺癌中，槲皮素发挥雌激素样的作用，可以抑制乳腺癌细胞的增殖[4-5]。在肝癌细胞中，槲皮素可以通过诱导细胞凋亡而抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖[6-8]。而在结肠癌中，槲皮素可以通过上调p21和p27蛋白的表达，使人结肠腺癌细胞RKO的细胞周期阻滞于G0/G1期，从而抑制人结肠腺癌细胞RKO的增殖[9]。同样的，在卵巢癌细胞中，槲皮素也可以阻止细胞周期从G0/G1期向S期的转换，从而抑制卵巢癌细胞的增殖[10]。本研究MTT的结果显示，在槲皮素处理时间相同的条件下，随着槲皮素浓度的增加，槲皮素对于SiHa细胞活力的抑制作用逐渐增强。

同样的，在槲皮素浓度相同的条件下，随着作用时间的增加，槲皮素对于SiHa细胞活力的抑制作用也逐渐增强。因此，槲皮素可以抑制SiHa细胞的细胞活力和细胞增殖。此外，通过流式细胞仪分析槲皮素处理后SiHa细胞中细胞周期的变化，发现SiHa细胞经过20、40和80μmol/L浓度的槲皮素分别处理48h后，处于G0/G1期的细胞百分比与对照组相比均出现了增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；而SiHa细胞经过20、40和80μmol/L浓度的槲皮素分别处理48h后，处于S期的细胞百分比与对照组相比均出现了减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。可见，槲皮素可以阻滞细胞周期从G0/G1向S期的转换，增加G0/G1期的细胞数量，同时减少S期的细胞数量，这些结果与槲皮素在结肠癌[10]以及卵巢癌[11]中所观察到的可以阻滞肿瘤细胞从G0/G1期向S期转换的结果是一致的。

此外，通过检测周期相关蛋白CyclinD1的表达发现，槲皮素可以下调SiHa细胞中CyclinD1蛋白的表达，随着浓度的增加，槲皮素对CyclinD1表达抑制的作用出现了进一步的加强。因此，结合MTT以及细胞周期的结果，推测槲皮素可以通过下调SiHa细胞中CyclinD1蛋白的表达，从而阻滞肿瘤细胞从G0/G1期向S期的转换，抑制SiHa细胞的增殖和活力。综上所述，槲皮素可以抑制SiHa细胞的增殖和活力，而这种抑制作用可能是通过调节周期相关蛋白CyclinD1的表达来实现的，但是槲皮素具体通过何种途径实现其对CyclinD1表达的调控还有待进一步的研究。

参考文献：

[2]赵蕾，赵雪梅，马朋，等.槲皮素抗肿瘤作用的研究新进展[J].现代中药研究与实践，2013，27（3）：78-81.

[3]孙涓，余世春.槲皮素的研究进展[J].现代中药研究与实践，2011，25（3）：85-88.

[4]柯昌虎，朱雪松，朱军，等.槲皮素抗乳腺癌作用机制的研究进展[J].中国医院药学杂志，2016，36（16）：1420-1425.

[6]史桂兰，黄琳，卿海燕，等.槲皮素对人肝癌SMMC-7721细胞生长抑制及诱导凋亡作用[J].中国实验诊断学，2015，19（1）：17-19.

[7]陈兆勋，高彦宇，李冀.不同浓度槲皮素对人肝癌细胞株Hep3B、Huh7细胞凋亡的影响[J].中医杂志，2015，56（12）：1051-1053.

[9]邱雪梅，马超英.槲皮素抗结肠癌的研究进展[J].中华中医药学刊，2015，33（10）：2333-2335.

[10]邓晓慧，宋海岩，孙春莉.槲皮素对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖的影响[J].中国病理生理杂志，2013，29（1）：99-102.

作者：张欣；董春力；付丽丽；杜鹃；李少闻