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鼻腔鼻窦鳞状癌细胞研究

2017/02/10 阅读:

[摘要目的探讨促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)在鼻腔鼻窦鳞状细胞癌(SNSCC)中表达的临床意义。方法采用免疫组织化学及逆转录PCR(RT-PCR)方法检测62例SNSCC组织(SNSCC组)中PRL-3蛋白的表达水平,并对30例鼻息肉患者(NP组),以及25例正常鼻腔黏膜(对照组)做相同蛋白表达并进行对比。结果在蛋白水平和基因水平检测,均发现SNSCC组中PRL-3的表达高于NP组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。PRL-3的表达情况在不同的性别、年龄中差异无统计学意义(P>0.05),而随着TNM分期的增高,分化程度的降低及合并淋巴结转移,PRL-3的表达明显增高(P<0.05)。结论PRL-3的表达可以对SNSCC的增殖活性作很好的参照,表达强度可明显反映SNSCC细胞增殖活性,PRL-3可能是SNSCC的一个独立预后指标,提示预后不良。

[关键词]鼻腔;鼻窦;癌,鳞状细胞;促肝细胞再生磷酸酶-3

促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)属于酪氨酸蛋白磷酸酶,它是目前发现的与恶性肿瘤细胞的转移相关的一个重要基因,它可以促进恶性肿瘤细胞的增殖黏附及迁移[1]。目前,鲜见PRL-3在鼻腔鼻窦鳞状细胞癌(SNSCC)中的表达及意义的报道,其与SNSCC的生长、浸润和转移关系尚待研究。本研究就采用免疫组织化学及逆转录PCR(RT-PCR)的方法检测PRL-3在SNSCC中的表达情况,分析PRL-3与SNSCC临床病理特征的关系,探讨PRL-3与SNSCC分化、转移及预后之间的关系,为临床早期诊断SNSCC提供参考。

1资料与方法

1.1一般资料

收集本院2007年12月至2014年12月手术切除或活检的62例SNSCC组织(SNSCC组),30例鼻息肉(NP组)和25例接受中鼻甲部分切除术患者的切除中鼻甲黏膜组织(对照组)。其中,SNSCC组男39例,女23例,年龄32~77岁;NP组男19例,女11例,年龄16~70岁;对照组男13例,女12例,年龄18~53岁。SNSCC组均未接受任何的放化疗或免疫治疗。所有标本取材后平分为两份,一份送病理科做成石蜡块,另一份放入液氮中冰冻保存。

1.2方法

1.2.1主要试剂

鼠抗人PRL-3单克隆抗体,购自武汉博士德生物工程有限公司;羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)/辣根酶标记二抗和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;Trizol、逆转录试剂盒购自Takara公司;PCR引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司;50bpDNALadder购自北京天根生化有限公司。

1.2.2免疫组织化学(SP法)检测PRL-3的表达

取包埋石蜡块、4μm连续切片。按SP法试剂盒操作规程说明书进行免疫组织化学染色,切片常规脱蜡、水化,进行抗原修复,经DAB显色,苏木素复染后,脱水、封片。用已知阳性标本阳性对照,磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照。结果判定:PRL-3阳性表达为在细胞膜及膜周细胞质中出现棕黄色颗粒,每张切片取5~8个高倍视野进行观察,每个视野的细胞计数为100个,取平均数,根据阳性细胞百分比来对PRL-3阳性细胞数进行判断,≤25%为(-),>25%~<51%为(+),51%~75%为(++),>75%为(+++)。

1.2.3RT-PCR法检测PRL-3的表达

冻存的SNSCC标本按Trizol一步法,提取总RNA,将2μg总RNA为模板逆转录为cDNA,以cDNA产物为模板,PRL-3和GAPDH为引物,行PCR扩增。根据已知PRL-3基因序列,上游引物序列:5′-GGGACTTCTCAGGTCGTGTC-3′,下游引物序列5′-AGCCCCGTACTTCTTCAGGT-3′。β-actin上游引物序列5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′,下游引物序列5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。严格按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作,荧光定量PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,63℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环。72℃终延伸10min,取PCR产物行质量分数1%琼脂糖凝胶电泳分析,经溴化乙锭显影后,凝胶成像系统成像,并进行光密度半定量分析。目的基因的相对表达量以目的条带积分光密度(OD)值与内参照条带OD值的比值表示。

1.3统计学处理

采用SPSS13.0进行描述分析,计量资料用x±s表示,组间比较采用t检验;计数资料用率表示,组间采用χ2检验(必要时用Fisher精确法)等级资料两组间比较用Wilc-oxon秩和检验。检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1PRL-3蛋白在3组患者标本组织中的表达情况

PRL-3蛋白在SNSCC组(75.81%)中的表达显著高于在对照组(20.00%)及NP组(40.00%)中的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2PRL-3蛋白在SNSCC组织中的表达与临床病理特征的关系

PRL-3蛋白在SNSCC中的表达与病理分期、分化程度及合并淋巴结转移有关(P<0.05),与性别、年龄无关(P>0.05)。

2.3RT-PCR法检测PRL-3蛋白在3组组织中的表达

SNSCC组中的PRL-3mRNA相对表达量(0.89±0.09)明显高于NP组(0.57±0.06)及对照组(0.21±0.02)(P<0.05)。RT-PCR反应后电泳结果。

3讨论

PRLs属于一类酪氨酸蛋白磷酸酶,其家族包含3个亚型,即PRL-1、PRL-2和PRL-3。而其中以PRL-3在肿瘤中的生物活性最显著。PRL-3位于染色体8q24.3上,含有PTP催化位点序列,其编码蛋白产物含有一个保守的C-末端半胱氨酸CAAX残基-异戊烯化结构域,此结构域内的Cys104和Arg110保守催化残基与PRL-3的酶活性有关。PRL-3蛋白在人的骨骼肌、胰腺组织及心肌细胞中有不同程度的表达,而脑肺肝肾等组织鲜有表达。它具有促进细胞生长和增殖,增强恶性细胞迁移和浸润能力,还有促进细胞恶化及转移等多种功能[4-7],具体作用机制包括以下几点:(1)PRL-3可通过激活Rho信号转导途径,调控肿瘤细胞的侵袭和活动性,促进肿瘤细胞的增殖及转移;(2)PRL-3可通过介导ERK信号传导通路,促进肿瘤血管的生成,从而促进肿瘤的生长及成熟,促进淋巴结转移及远处转移;(3)PRL-3可通过诱导促进血管内皮生长因子(VEGF)及其受体的过度表达,促进肿瘤的生长、侵袭及转移;(4)PRL-3还可通过调节其他癌症相关基因的表达来介导肿瘤的侵袭、转移;(5)PRL-3通过正调控PI3K细胞通路,抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤细胞分裂增殖,诱导肿瘤细胞生长。此外,PRL-3还可通过调节PI3K通路促进肿瘤的侵袭及转移;(6)PRL-3可促进转移性肿瘤的形成。

本研究显示,SNSCC组织中的PRL-3的表达明显高于NP组织及正常鼻腔黏膜组织,而且与SNSCC的TNM分期、分化程度及淋巴结转移密切相关。此结果提示在SNSCC的发生、发展及转移过程中PRL-3可能发挥了重要的作用。因此,检测PRL-3可能对早期发现SNSCC具有重要的临床意义,同时,对SNSCC生物学行为、预后具有重要意义,有可能成为SNSCC治疗的靶点及预后标记物。本研究对PRL-3高表达与SNSCC的发生、发展及转移的关系在分子水平上提供了一些理论基础,但其具体作用机制,尤其是PRL-3通过何途径促进SNSCC转移的,仍需进一步探讨。

参考文献

[1]孙振华,卜平.胃癌PRL-3与Bmi-1mRNA联合表达的定量分析及其意义[J].广东医学,2012,33(7):987-989.

[2]郭延林,朱彦君,伍青.PRL的生物学功能及与肿瘤关系的研究进展[J].现代肿瘤医学,2013,21(3):659-662.

作者:陆鸿略1,马桂琴1,岳卓立1,康菲2 单位:承德医学院附属医院:1.耳鼻咽喉科;2.体检科

鼻腔鼻窦鳞状癌细胞研究

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