rmhTNF对阳性胃癌细胞的影响范文

1材料与方法

1.1Δ133p53、p53、Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax和CyclinB1mRNA表达的nRT-PCR检测取对数生长期细胞，均匀接种于六孔板中，分别加入0、50IU/ml、100IU/ml浓度的rmhTNF，培养24h后收集细胞。用Trizol试剂提总RNA，紫外分光光度仪检测mRNA浓度和纯度，M-MULV第一链cDNA合成试剂盒逆转录，PremixTaqPCR扩增。BIO-RADMyCyderPCR仪中反应条件为94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，56～58℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min，1个循环，反应体系为25μl（引物序列见Table1）。PCR产物各5μl在2％琼脂糖凝胶上电泳100V、20min，溴乙锭（EB）染色。BioSpectrumAC凝胶成像分析系统观察nRT-PCR结果。

1.2统计学处理采用SPSS17.0软件，各组实验数据以x±s表示，各组间差异采用单因素方差分析，然后两两比较采用LSD-t检验，两变量间相关性采用Person直线相关分析，检验水准α=0.05。

2结果

2.1rmhTNF对MKN45增殖的影响不同浓度rmhTNF（50、100、200、400、500IU/ml）作用于MKN45细胞24h后，细胞抑制率，分别为23.180%±10.172%，37.219%±5.350%，48.665%±4.502%，59.830%±6.949%和70.388%±6.322%，提示rmhTNF对MKN45抑制率随浓度增加而增加（F=35.683，P<0.001）。rmhTNF（50IU/ml）作用于MKN45细胞24、48、72h后，细胞抑制率分别为23.180%±10.172%，57.082%±4.045%，68.196%±4.108%，可见rmhTNF对MKN45细胞抑制率随时间增加而增加（F=60.328，P<0.001）。

2.2不同浓度rmhTNF对Δ133p53、p53、Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax和CyclinB1mRNA的影响rmhTNF（0、50、100IU/ml）作用于MKN45细胞24h后，nRT-PCR结果显示MKN45细胞Δ133p53、Mdm2、CyclinB1mRNA的表达量随浓度增加而降低(P＜0.05)，p53、Gadd45α、PTEN、BaxmRNA的表达量随浓度增加而增加(P＜0.05)，见Table2，Figure1。

2.3MKN45细胞中Δ133p53与p53、Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax、CyclinB1mRNA表达相关性MKN45细胞中随rmhTNF作用浓度增加，Δ133p53、Mdm2、CyclinB1相对表达呈量递减趋势，p53、Gadd45α、PTEN、Bax相对表达量呈增长趋势。Pearson直线相关分析结果显示，MKN45细胞Δ133p53表达水平与p53、Gadd45α、PTEN、Bax表达水平呈负相关（r=-0.916，P<0.01；r=-0.894，P<0.01；r=-0.872，P<0.01；r=-0.971，P<0.01），与Mdm2、CyclinB1表达水平呈正相关（r=0.924，P<0.01；r=0.943，P<0.01），见Figure2。

3讨论

胃癌的发生是多种因素共同作用的结果，p53功能失活在胃癌的发生、发展过程中起重要作用。p53基因突变已有研究，但其作用机理尚未完全阐明，p53异构体的发现为胃癌发生机制的研究提供了新方向。近年来，有关p53异构体和人类肿瘤关系的研究不断增多，发现Δ133p53、Δ40p53异构体促肿瘤生长，p53β、p53γ抑制肿瘤生长。Δ133p53是第4内含子的内部启动子的选择性剪接，导致p53蛋白氨基末端截短［9］。本课题组前期研究中，张红梅等发现，Δ133p53mRNA的表达率在正常癌旁组织→浅表性胃炎→慢性胃炎→胃腺癌中逐步上升，具有显著性差异，提示胃癌的发生过程伴随着异构体的动态变化。Wei等研究结果证明，Δ133p53在幽门螺杆菌感染相关胃炎→胃癌过程中起诱导因子作用。这些结果提示，研究Δ133p53异构体的功能和生物学效应，对于理解胃癌的发生发展具有重要的价值。本实验结果显示，rmhTNF对MKN45胃癌细胞系的抑制率与Δ133p53mRNA的表达率相反，且随细胞抑制率增加Δ133p53表达率升高。既往研究发现，Δ133p53与野生型p53具有拮抗作用，通过抑制p53的功能，而抑制细胞凋亡。Sabour等研究表明，p53可激活并上调Gadd45基因，Gadd45通过与Cdc2形成复合物，导致Cdc2/CyclinB1复合物解离，从而细胞周期G2/M期阻滞，同时下调CyclinB1基因。研究证实，胃癌中突变型p53的表达较胃炎组织明显升高，而PTEN下降，提示突变型p53蛋白升高可能阻碍PTEN蛋白的表达。Bax基因是一种促凋亡基因，Marcel等通过荧光素酶实验研究表明，共转染Δ133p53和FLp53异构体之后，作用于Bax启动子可抑制p53的转录表达。以上研究表明，p53基因的生物学功能与Gadd45α、CyclinB1、PTEN、Mdm2、Bax表达密切相关。本研究结果发现，Δ133p53表达水平与p53、Gadd45α、PTEN、Bax表达水平呈负相关，与Mdm2、CyclinB1表达水平呈正相关，进一步验证了Δ133p53对野生型p53的调控作用，这种调控体现在对下游分子Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax、CyclinB1的选择性启动，提示rmhTNF对MKN45胃癌细胞系的抑制可能与该机制有关。由此可见，Δ133p53可能是rmhTNF治疗胃癌生物学效应的关键靶点，为胃癌诊断、治疗、以及预后研究提供依据。

作者：姜琪琪 张娜 郭爱 李伟 张红梅 季万胜 单位：潍坊医学院 潍坊医学院附属医院