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胃腺癌细胞论文范文

时间:2022-04-23 04:04:51

胃腺癌细胞论文

1材料与方法

1.1方法

1.1.1细胞培养人胃癌细胞SGC-7901细胞株和SGC-7901/DDP培养于RPMI-1640培养液(90%)和胎牛血清(10%)、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的混合培养基中,在5%CO2、37℃的温箱培养。SGC-7901/DDP在无药物培养基连续培育7d,然后将顺铂(终浓度800ng/ml)添加到SGC-7901/DDP的RPMI-1640培养基。2~3d进行一次消化传代,使细胞处于对数生长期。

1.1.2彗星实验(singlecellgelelectrophoresis,SCGE)取处于对数生长期的SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞,以0.25%胰蛋白酶消化,用RPMI-1640培养基制备成浓度为1×105个/ml单细胞悬液,台盼蓝染色细胞存活率>90%进行SCGE。取110μl已熔化的0.5%正常熔点琼脂糖浇注到全磨砂载玻片上,4℃固化10min后,依次加入10μl细胞悬液与75μl0.5%低熔点琼脂糖的混合液,4℃固化10min,固化后的玻片沉浸在细胞裂解液中,4℃避光裂解1h。PBS清洗载玻片后用碱性电泳液浸没载玻片4℃避光解旋DNA20min。将电泳仪电压维持25V,电流维持在0.3A,恒压恒流4℃电泳25min,注意避光操作。然后用中和缓冲液(pH7.4)漂洗,用甲醇固定,滴加30μl浓度为20μg/ml的EB染液进行染色。400倍荧光显微镜下紫外光激发显像,随机转动视野拍摄30个细胞的SCGE检测图像,实验独立重复3次[2]。

1.1.3细胞形态学观察通过倒置显微镜下观察SGC-7901和SGC-7901/DDP形态的不同,拍照记录。

1.1.4细胞划痕实验取状态良好的人胃腺癌细胞株SGC-7901和SGC-7901/DDP,胰蛋白酶消化,5×106个/ml制备接种到24孔板,5%CO2、37℃的温箱培养,细胞长成单层后丢弃介质,用灭菌枪头借助无菌尺在每孔的底部中间划一个“十”字伤口,用PBS轻轻清洗3遍,洗去悬浮的细胞,每孔加入2ml的无血清的RPMI-1640培养基培养,分别于0、12、24h在交叉处拍照,利用Imageproplus软件测量划痕的间距,细胞划痕迁移率(%)=(0h划痕的间距-不同时间点的划痕间距)/0h划痕的间距×100%,每次实验做3个复孔,实验独立重复3次。

1.1.5MTT法检测药物的敏感性取状态良好的人胃癌SGC-7901和SGC-7901/DDP,将浓度为7×104个/ml的细胞加入到96孔板中,每孔100μl体积,过夜培育。当达到80%~90%细胞密度,加化疗药物干预,并设置不同浓度(以上每组3个平行孔)48h,同时设置调零孔和无药物孔。顺铂(0.03、0.3、3、30、60μg/ml)、5-氟尿嘧啶(0.1、1、10、100、200μg/ml)、依托泊苷(5、10、20、40、80μg/ml)、表阿霉素(0.01、0.1、1、10、100μg/ml)、多西紫杉醇(5、10、20、40、80μg/ml)、奥沙利铂(5、50、100、200、400μg/ml)。在实验孔加入MTT(5mg/ml)20μl,37℃培育4h,注意避光操作。结束培育,将上清液完全吸去,各孔加入DMSO150μl,振荡15min,使结晶充分溶解。用酶联免疫吸附法在570nm波长检测各孔光密度值(opticaldensity,OD),求3孔的平均值,实验独立重复3次。细胞存活率(%)=(实验组OD平均值/对照组的OD平均值)×100%,同时计算出各类药物的半数抑制率(halfmaximalinhibitoryconcentrationofasubstance,IC50),细胞对不同药物的耐药倍数=SGC-7901/DDP对不同化疗药物的IC50/SGC-7901对化疗药物的IC50。

1.2统计学处理采用SPSS19.0统计软件分析。数据以珋x±s表示,单变量两组之间的比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。

2结果

2.1人胃腺癌细胞株SGC-7901和SGC-7901/DDP的DNA损伤修复能力的差异SCGE的结果是利用CASP软件分析尾长作为DNA损伤与修复的评价指标。人胃腺癌细胞SGC-7901和SGC-7901/DDP的彗星尾长分别为29.71±4.45和20.38±3.48(t=16.67,P<0.05),见图1、2。

2.2细胞形态人胃腺癌SGC-7901细胞显微镜下观察为单层、形状规则、大小均匀、高折射率、细胞边界、核大、圆形或椭圆形;人胃癌SGC-7901/DDP细胞呈不规则、细胞大小不均一、多核、折光度低,见图3。

2.3细胞划痕实验用显微镜测量人胃腺癌SGC-7901和SGC-7901/DDP在0、12、24h细胞划痕的宽度,结果显示:SGC-7901细胞12、24h划痕宽度比SGC-7901/DDP细胞划痕宽度明显缩小(F=77.12,P<0.05),SGC-7901的迁移能力比SGC-7901/DDP的迁移能力强,见图4、5。

2.4胃腺癌SGC-7901/DDP对各类化疗药的敏感性人胃腺癌细胞SGC-7901和SGC-7901/DDP对不同药物的敏感性,顺铂、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、依托泊苷、多西紫杉醇对顺铂耐药株及其亲本细胞SGC-7901的IC50和耐药倍数见表1,SGC-7901/DDP对顺铂耐药的同时对表阿霉素、5氟尿嘧啶、依托泊苷、奥沙利铂也具有不同程度的耐药。

3讨论

目前已有大量的实验致力于对顺铂耐药性的研究,其中DNA的损伤修复作用引起广泛关注,核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair,NER)是DNA修复的重要途径,核苷酸切除修复交叉互补基因1(excisionrepaircross-complementinggene1,ER-CC1)蛋白是顺铂诱导NER中的关键酶,ERCC1是可以识别DNA损伤和断开链间交联的功能,研究表明,ERCC1mRNA和蛋白的过表达使DNA修复能力的增强与临床胃癌患者顺铂化疗疗效呈负相关性。然而,目前对NER能力的检测多用于临床胃癌组织,无法反映肿瘤的生物学行为发生变化所导致的NER的变化,有学者提出外周血淋巴系统与肿瘤细胞携带有同源基因,均具有相同的NER系统。

本研究以人胃腺癌SGC-7901及其顺铂耐药株SGC-7901/DDP作为研究对象,用SCGE的方法检测在人胃腺癌SGC-7901细胞株和其顺铂耐药株SGC-7901/DDP的DNA修复能力,结果显示人胃腺癌SGC-7901/DDP较其亲本细胞的DNA修复能力强;此结果表明肿瘤细胞的DNA的修复能力与对顺铂的敏感性呈负相关,与临床研究结果一致。同时本研究在表明人胃腺癌SGC-7901顺铂耐药后其DNA修复能力增强的基础上,用MTT的方法检测SGC-7901顺铂耐药株对其他化疗药物的敏感性是否发生变化,结果显示SGC-7901/DDP对顺铂耐药的同时对表阿霉素、5氟尿嘧啶、依托泊苷等也具有不同程度的耐药,可能由于表阿霉素、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、多西紫杉醇均通过与DNA作用而发挥细胞毒性,由于胃癌顺铂耐药细胞株的DNA修复能力增强,一定程度抑制其发挥细胞毒性作用,并且有研究表明,肿瘤细胞内顺铂积累的减少,是肿瘤细胞产生耐药的重要原因,多药耐药基因1是编码P糖蛋白和多药耐药相关蛋白(multi-drugresist-ance-associatedprotein,MRP)的基因,P糖蛋白是一种跨膜蛋白,其通过ATP供能,将药物泵出细胞;MRP也是一种能量依赖的运输蛋白,其主要是识别与谷胱甘肽形成MRP-1-ATP,自动把药物从细胞内转移到细胞外,从而让细胞内药物浓度降低,药物抵制肿瘤的影响削弱甚至消失,使细胞获得耐药性。本研究通过细胞划痕实验显示SGC-7901/DDP的迁移能力较正常的胃癌细胞株SGC-7901减弱,可能是顺铂进入细胞后形成稳定的Pt-DNA加合物,并且顺铂与金属硫蛋白的稳定结合使细胞黏附稳定、不易软化、较正常细胞株不易转移。

作者:黄娜娜张逸寅顾康生单位:安徽医科大学第一附属医院肿瘤科

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