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结直肠癌细胞论文范文

时间:2022-04-23 04:01:51

结直肠癌细胞论文

1材料与方法

1.1小鼠DC细胞分离培养[6-7]断颈处死小鼠,75%酒精中浸泡5min,超净台中无菌取出小鼠的股骨、胫骨,剪去两端,用1mL注射器吸buffer刺入骨髓腔,反复冲洗直至骨发白,200目滤网冲过滤,收集细胞悬液,离心(300g,10min),加入红细胞裂解液,离心去上清,buffer清洗沉淀后再次离心。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞,接种于24孔板(1×106/mL),加入细胞因子GM-CSF50ng/mL、IL-425ng/mL,37℃,5%CO2,进行培养。48h后,弃培养基,PBS清洗1遍,加入新的培养基。之后隔天半量换液。第8天加入LPS继续培养24h,离心收集的悬浮细胞即为DC细胞。

1.2CT26.WT细胞与全T细胞共培养37℃,5%CO2培养的CT26.WT细胞待密度超过80%,胰酶消化,计数待用。T细胞∶CT26.WT(10∶1)进行混合培养,48h后做实验研究。

1.3DC细胞与T细胞共培养腹腔注射第1、15天的DC细胞与对应的T细胞,调至适当浓度至1×106个/mL(DC∶T=1∶10),加入96孔板,100μL/孔,混合培养48h。每组设5个复孔,同时设单独DC细胞孔、单独T细胞孔。刺激能力的计算:(混合孔-单独DC细胞孔)/单独T细胞孔。

1.4B7H4的检测取新鲜的人结直肠癌组织及配对的正常肠上皮组织8对;CT26.WT细胞腹腔注射第15天的BALB/c小鼠,待腹腔成瘤后,取肿瘤组织及配对的正常肠组织1对,IHC检测B7H4的表达;腹腔注射的第0、1、2周,取小鼠肠组织及肿瘤组织,WesternBlot检测组织蛋白B7H4的表达。

1.5统计学方法所有数据采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析、t检验等。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1DC细胞在镜下的细胞形态第8天可见多数细胞呈集落样生长。

2.2腹腔注射不同时间段的全T细胞对CT26.WT的杀伤效应腹腔注射不同时间段(1、3、5、7、9、11、15d)全T细胞与CT26.WT(10:1)混合共培养48h后,CCK8结果示第7天,活细胞数开始略上升,第15天最高(第1天:OD=1.24400±0.25146;第15天:OD=3.05767±0.86557;P=0.000,差异有统计学意义,图2);第1、15天的共培养体系进行细胞凋亡检测:第15天细胞凋亡率降低(第1天:CT26凋亡率8.667±0.4055;第15天:CT26凋亡率3.633±0.4910;P=0.001,差异有统计学意义)。

2.3流式细胞术检测DC细胞表型腹腔注射的第1、15天,DC细胞表面分子MHC-Ⅱ阳性率(79.000±1.9348vs51.000±2.9180)比较,差异有统计学意义。

2.4DC细胞表面分子ICAM-1的表达搜集腹腔注射不同时间段(0d-正常小鼠,1、3、5、7、9、11、15d)的DC细胞,WesternBlot检测ICAM-1的表达。第9天其表达开始下降,第15天最低。

2.5IHC检测B7H4在正常肠上皮(N)和癌组织(T)中的表达WesternBlot检测腹腔注射不同时间段小鼠组织B7H4的表达9对组织(8对人来源的,1对鼠来源的)均显示B7H4在癌组织中表达增高(图5)。腹腔注射第0、1、2周,正常肠上皮组织(第0周)B7H4表达很微弱,第1、2周,腹腔内已有肿瘤形成,肿瘤组织B7H4表达上升。2.6腹腔注射1、15天,DC细胞刺激T细胞增殖能力的比较第1天:2.77±0.017214;第15天:2.33±0.016836;P=0.000,差异有统计学意义。

3讨论

肿瘤免疫机制是一个复杂的网络系统,已有研究发现:B7H4可以抑制T细胞的激活和增殖;TGF-β可以诱导免疫抑制[12];结直肠癌来源的成纤维细胞可以抑制自然杀伤细胞的功能等[13]。1970年,Bretscher和Cohn已证实“协同刺激信号”决定着T细胞免疫的方向,在宿主抵抗外来入侵时至关重要,而T细胞活化的第一信号就来源于APC所提呈的抗原。DC细胞是1973年由Steinman等[14]首先发现的,是目前所知抗原提呈能力最强的APC,而T细胞活化则需要两个信号:第1信号来自DC等细胞提呈的抗原,第2信号则为共刺激分子包括B7/CD28、ICAM-1/LFA-1、LFA-3/CD2等,缺乏任一信号T细胞都不能有效地发挥处理肿瘤细胞的能力。

本研究将CT26.WT腹腔注射入BALB/c小鼠体内,动态观察其对宿主产生的影响,利用该细胞株的高侵袭性,短时间内构建肿瘤与免疫的模型。利用T细胞与肿瘤细胞共培养,发现T细胞的杀伤能力下降,其后对这一结果做进一步研究,着重观察抗原递呈的改变。发现随着腹腔注射时间的延长,抗原提呈细胞DC细胞表面分子MHC-Ⅱ的表达降低;LFA-1/ICAM-1参与T细胞的活化、增殖、分化及归巢等多种生理过程,WesternBlot检测发现DC细胞表面分子ICAM-1表达也下降。最终使T细胞杀伤CT26.WT细胞的能力下降。另外,肿瘤细胞表面分子发生改变也是肿瘤逃逸的原因,本研究取新鲜的结直肠癌组织标本,以及腹腔注射第1、2周的小鼠结肠癌组织,免疫组化及WesternBlot检测均发现肿瘤高表达B7H4,这又进一步抑制了T细胞的活化。综合以上对BALB/c小鼠体内外实验的初步探究,提醒我们在关注肿瘤本身的同时,也应将眼光聚焦于与肿瘤生存密不可少的免疫环境。研究表明用肿瘤细胞mRNA致敏DC细胞可以产生特异性抗肿瘤反应,了解高表达B7H4的肿瘤细胞与DC细胞之间的微观分子机制,明确DC细胞与肿瘤的相关信号转导途径的关系,将对肿瘤的治疗与预防有着重要的意义。

作者:冯娜周娜邓永键单位:南方医科大学基础医学院病理学系

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