慢病毒下的胃癌细胞论文范文

1材料与方法

1.1方法

1.1.1STAT3-shRNA慢病毒表达载体的构建选择GenBank提供的STAT3基因序列（NM_139276.2）为靶基因，委托上海纽恩公司设计多个RNA干扰靶点序列，结合设计软件评估测定结果及公司设计经验，最终确定并合成shRNA序列：5’-AACTTCAGACCCGTCAACAAA-3’，进一步合成双链DNAoligo，退火后与AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pLKD.CMV.G&PR.U6.shRNA连接，转化细菌感受态细胞，对长出的克隆进行PCR鉴定，测序比对正确后，抽提重组质粒，与包装质粒psPAX2、外膜质粒pMD2.G共转染293T细胞完成病毒组装。离心去除细胞碎片并用0.45μmPESfilterflask过滤收集上清液，100000×g，4℃超速离心2h后得到浓缩的STAT3-shRNA病毒液。同法构建阴性对照病毒。进一步梯度感染293T细胞，荧光显微镜下计算绿色荧光蛋白（greenflu－orescentprotein，GFP）数目，计算病毒滴度。测得干扰病毒滴度为：3.80×108Tu/ml，阴性对照病毒滴度为：6.51×108Tu/ml。

1.1.2细胞培养用含10％小牛血清、1％的青/链霉素双抗的RPMI1640培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养SGC-7901细胞，每3天按1∶3的比例传代。

1.1.3慢病毒转染SGC-7901细胞实验共分为3组：实验组（STAT3-shRNA转染组）、阴性对照组（空病毒载体转染组）、空白对照组（正常SGC-7901细胞）。SGC-7901细胞按1×106个/孔均匀接种至6孔板，长至汇合度为30％～40％时，加入慢病毒（感染复数MOI=20），12h后更换为新鲜的无病毒培养基。

1.1.4激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）各组细胞按2×103个/孔均匀接种至装有灭菌爬片的24孔板中，48h后弃培养基，PBS溶液洗3次，4%多聚甲醛固定10min，轻轻取出爬片并倒扣于载玻片上，甘油封片后用激光共聚焦显微镜观察。

1.1.5Real-timePCR检测STAT3基因表达收集各组细胞1×106个，trizol法抽提总RNA，紫外分光光度计测RNA纯度及浓度后逆转录为cDNA，反应条件为：42℃60min，95℃5min，5℃5min。取2μlcDNA模板进行PCR。STAT3上游引物序列为：5’-GAGGACTGAGCATCGAGCA-3’，下游引物序列：5’-CATGTGATCTGACACCTGAA-3’，扩增产物长85bp；内参引物β-actin上游序列为：5’-CTGGAACGGTGAAGGT－GACA-3’，下游引物序列：5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATG－CA-3’，扩增产物长140bp。PCR反应条件：95℃30s，95℃5s及60℃30s共循环40次。每个样本设3个复孔，采用2-ΔΔCt公式比较mRNA相对表达水平，ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值。

1.1.6Westernblot检测STAT3、Bcl-2、survivin及Mcl-1蛋白表达收集各组细胞，裂解缓冲液（裂解液∶蛋白酶抑制剂混合物=500∶2）冰上裂解15～20min，4℃、12000r/min离心15min以分离细胞碎片。BCA蛋白定量法测蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸至完全变性。50μg总蛋白提取物在10％SDS-PAGE凝胶上分离，然后转至PVDF膜（90V，1.5h）。室温下用含5％脱脂奶粉的TBST溶液孵育1h以阻断非特异性结合，一抗（STAT3稀释比例为1∶2000，Bcl-2、survivin及Mcl-1稀释比例为1：200）4℃孵育过夜，TBST洗膜3次×5min；二抗（1∶2500）37℃孵育2h，TBST洗膜3次×5min，最后用ECL化学发光法显影。应用QuantityOne软件分析图像，蛋白相对表达强度用目的基因条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。

1.1.7MTT法分析5-Fu的化疗敏感性将细胞均匀接种至96孔板（5×103个/孔），贴壁后加入5-Fu至终浓度分别为0、5、10、15、20、50、100μg/ml，每个浓度设3个复孔。48h后每孔加20μl5mg/ml的MTT溶液，37℃孵育4h，弃培养基，每孔加150mlDMSO溶液。摇床上震荡15min，用酶标仪测定570nm处吸光度值（absorbance，A）。以不加5-Fu组作对照，计算各组细胞的增殖抑制率，公式为：增殖抑制率（100％）=[对照组A570nm－实验组A570nm]/对照组A570nm×100%。

1.1.8流式细胞仪比较细胞凋亡差异细胞接种至6孔板，贴壁后加入5-Fu至终浓度为20μg/ml。48h后，收集4×105个细胞，PBS洗涤2遍后用195μlAnnexinV-PE结合缓冲液重悬细胞，加入5μlAnnexinV-PE（带红色荧光），混匀后室温下避光孵育10min，离心弃上清，加入200μl结合缓冲液，尽快送流式细胞仪检测。

1.2统计学处理实验均重复3次，使用统计分析软件SPSS17.0处理数据，用均数±标准差（x±s）表示数据，以单因素方差分析法比较多组间差异，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1GFP在SGC-7901细胞中的表达慢病毒感染SGC-7901细胞后，在激光共聚焦显微镜下观察到细胞生长状态良好，可见实验组及阴性对照组均有明显GFP表达（图1）。

2.2STAT3-shRNA转染后STAT3mRNA及蛋白表达情况Real-timePCR结果（表1）所示，阻断STAT3信号后，STAT3mRNA相对表达水平下降为0.46±0.04，明显低于空白对照组1.00±0.01、阴性对照组0.93±0.05（P<0.05）。免疫印迹结果（图2、表1）显示，STAT3蛋白相对表达强度在空白对照组、阴性对照组及实验组中依次为0.78±0.07、0.75±0.05、0.47±0.04，表明STAT3-shRNA可明显下调STAT3蛋白活性（P<0.05），而阴性对照组和空白对照组之间无明显差异（P=0.528）。

2.3抑制STAT3表达后SGC-7901细胞对5-Fu的敏感性MTT结果（表2）示，与阴性对照组及空白对照组相比，实验组细胞增殖抑制率明显升高（P<0.05），表明STAT3-shRNA能抑制细胞增殖，增强细胞对5-Fu的化疗敏感性。

2.4慢病毒介导shRNA抑制STAT3后细胞凋亡率的变化抑制STAT3后细胞凋亡率（39.16±2.25）％，较阴性对照组（23.43±2.86）％、空白对照组（23.75±1.23）％明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），表明抑制STAT3表达能增强5-Fu的凋亡诱导作用（表3）。

2.5STAT3信号通路阻断后抗凋亡蛋白表达情况Westernblot结果表明（图3、表4），Bcl-2、Mcl-1及sur－vivin的蛋白表达水平在实验组中分别为0.47±0.03、0.35±0.02、0.45±0.02，空白对照组中为0.81±0.06、0.52±0.05、0.71±0.03，阴性对照组为0.78±0.07、0.49±0.01、0.67±0.05。与阴性对照组相比，实验组上述蛋白水平分别下调约40％、29％、33％（P<0.05），而两对照组之间无统计学差异（P>0.05）。

3讨论

5-Fu是胃癌化疗的一线药物，其通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶影响DNA的生物合成，属于抗代谢类化疗药物，然而其疗效往往因癌细胞获得多药耐药性（multidrugresistance，MDR）而受到极大影响[4]。MDR的形成机制十分复杂，耐药蛋白过表达、细胞凋亡异常、转录因子活化、药物代谢异常等皆可诱导MDR。研究证明，化疗药物发挥细胞毒性作用的主要机制是诱导凋亡，可由于肿瘤细胞内在的抗凋亡程序激活，使得其对化疗药物耐受，最终导致化疗失败[5]。STAT3作为络氨酸信号通路中的重要转录因子，通过调控多个下游靶分子介导细胞的增殖、分化及凋亡。在正常细胞中，STAT3的活化快速而短暂，而在肿瘤细胞中STAT3却能异常的持续活化，促进细胞不断增殖，抑制凋亡，诱导肿瘤血管生成及免疫逃逸，最终促进肿瘤发生与发展。Bcl-2、Mcl-1、survivin均是STAT3通路下游的靶基因，其中Bcl-2及Mcl-1是Bcl-2家族蛋白的主要成员，依赖线粒体途径抑制促凋亡因子的释放，抑制细胞凋亡[6]；survivin则是凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成员，主要依赖Caspase途径抑制细胞色素C释放从而抑制凋亡[7]。近来的研究认为，STAT3的异常活化与肿瘤细胞耐药有关，抑制STAT3可逆转细胞的化疗抵抗性。Liu等和Gu等[9]分别在黑色素瘤及头颈部鳞癌中发现，耐药细胞中STAT3表达水平较不耐药细胞明显上调，沉默STAT3可抑制肿瘤生长，逆转耐药细胞的化疗抵抗性。Duan等[10]发现，转染IL-6（STAT3的活性配体）可诱导卵巢癌细胞对紫杉醇耐药，利用siRNA沉默STAT3可增强紫杉醇的抗肿瘤活性。目前，STAT3沉默对胃癌细胞化疗敏感性影响的研究相对甚少，鉴于此，本实验拟阻断胃癌SGC-7901细胞的STAT3信号通路，观察5-Fu化疗敏感性的变化。

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术是利用体外合成的RNA序列特异性地结合并降解同源目的mRNA，使目的基因功能完全或部分丧失的生物学过程，可通过2种途径实现：一种是直接向细胞转染小干扰RNA（siRNA），另一种则是通过质粒、病毒或细菌载体将短发夹RNA（shRNA）传递至靶细胞[11]。siRNA由于存在易被血清核糖核酸酶降解、稳定性差、转运效率差等不足之处，因此本实验选择更加特异、稳定的shRNA以抑制靶基因表达。本研究通过构建靶向STAT3基因的慢病毒载体，介导shRNA转染SGC-7901细胞，在激光共聚焦显微镜下可观察到明显的GFP表达，real-timePCR及免疫印迹结果表明干扰后STAT3mRNA表达抑制率约为54％，蛋白水平下降达40％，说明STAT3在基因及蛋白水平均得到有效抑制。MTT及流式细胞仪检测发现STAT3-shRNA可增强5-Fu的增殖抑制及凋亡诱导作用，提示SGC-7901细胞对5-Fu的化疗敏感性升高。为了阐明其化疗增敏的机制，进一步检测了STAT3下游靶分子Bcl-2、Mcl-1、survivin蛋白的表达，发现三者的活性均明显下调，这与Liu[12]、Wen等[13]的实验结果一致，说明STAT3-shRNA能通过抑制STAT3表达进而下调该通路下游的抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、survivin的活性，诱导肿瘤细胞凋亡，使5-Fu的抗肿瘤活性增强。

总之，慢病毒介导的STAT3-shRNA能靶向抑制SGC-7901细胞中STAT3基因表达，通过阻断STAT3信号通路使下游的抗凋亡信号Bcl-2、Mcl-1、survivin的表达下降，促进细胞凋亡，在一定程度上提高胃癌细胞对5-Fu的化疗敏感性。本实验结果表明，靶向STAT3的基因治疗联合化疗，能逆转胃癌细胞对5-Fu的抵抗性，有可能成为胃癌治疗的有效新途径。但本实验仅为初步的体外实验，肿瘤细胞的耐药是涉及多种机制的复杂过程，尚需进一步开展动物实验验证。

作者：钟竹周伟吴小翎单位：重庆医科大学附属第二医院消化内科重庆市肿瘤医院放疗科