一氧化氮合成酶癌细胞论文范文

1方法

1．1细胞培养GES－1细胞株用DMEM培养液(10%胎牛血清，1%P/S双抗，1%HEPES缓冲液)进行培养;BGC－823和SGC－7901用RPMI－1640培养液(10%胎牛血清，1%P/S双抗，1%HEPES缓冲液)进行培养，在合适的湿度、5%CO2、37℃环境下行无菌培养。当细胞富集度达到75%左右，用0．25%的胰酶消化成单个细胞，进行传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1．2MTT对细胞增殖的检测将对数生长期的GES－1、BGC－823、SGC－7901细胞计数后以规定密度(4×104/mL)均匀接种于24孔(每孔500μL)培养板中，每组设4个复孔。培养24h，待细胞充分贴壁后，将培养液分别更换为含0、0．0001、0．01、1、10、100mmol/L的SNP培养液，继续培养12、24、48、72h后，加入MTT(5g/L)溶液30μL，继续培养4h，之后加入400μLFormazan溶解液过夜溶解，待紫色物质完全溶解后在酶标仪波长570nm处检测，实验重复3次。

1．3NO测试盒对NO浓度检测加入MTT之前，每孔取出100μL培养液放入1．5mL离心管内，加入NO测试盒内的试剂一200μL，混匀，再加入试剂二100μL，充分涡旋振荡后放置10min，然后离心(4000r/min)15min。取上清液160μL加入96孔板中，按试剂三:试剂四:试剂五为2．5:1:1的比例配成染色剂，在取出的上清液中每孔加入80μL，混匀，放置15min后在酶标仪波长550nm处检测并计算NO浓度。

1．4统计学分析实验数据为计量资料，均以mean±SD描述，多组间均数比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD，运用SPSS19．0统计软件进行统计学分析，检验水准α=0．05，P＜0．05表示差异有统计学意义。

2结果

2．1外源性NO对胃癌细胞BGC－823增殖的影响MTT检测结果表明，胃癌细胞株BGC－823在12、24、48、72h加入不同浓度SNP后，与对照组相比，胃癌细胞的增殖受到明显的抑制，且随着SNP浓度的增高其抑制作用逐渐增强(图1)。其中对0．0001mm/L浓度组和0．01mm/L浓度组对细胞增殖的抑制作用在12、24、48h组与对照组相比差异无统计学意义，而0．01mm/L浓度组在72h时与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0．01)，10mm/L浓度组与100mm/L浓度组相比差异无统计学意义。

2．2外源性NO对胃癌细胞SGC－7901增殖的影响MTT结果表明，胃癌细胞株SGC－7901在12、24、48、72h加入不同浓度SNP后，与对照组相比，胃癌细胞的增殖受到明显的抑制，且随着SNP浓度的增高其抑制作用逐渐增强(图2)。其中0．01mm/L、1mm/L浓度组、10mm/L浓度组、100mm/L浓度组在12、48、72h时对细胞的增殖作用与对照组相比差异有统计学意义(P＜0．01)，而0．01mm/L浓度组在24h时与对照组相比差异无统计学意义(P＞0．05)。

2．3外源性NO对正常胃粘膜细胞株GES－1增殖的影响MTT结果显示，正常胃粘膜细胞株GES－1在12、24、48、72h加入不同浓度SNP后，与对照组相比，细胞的增殖受到明显抑制，且随着SNP浓度的增高其抑制作用逐渐增强(图3)。其中0．0001mm/L浓度组、0．01mm/L浓度组和1mm/L浓度组在12h时对细胞的增殖作用与对照组相比差异无统计学意义(P＞0．05)，而在24h0．0001mm/L浓度组(P=0．00)、0．01mm/L浓度组(P=0．00)、1mm/L浓度组(P=0．00)与对照组相比，差异有统计学意义。在48h和72h0．0001mm/L浓度组与对照组相比差异无统计学意义，其他浓度组对细胞增殖都有抑制作用。

2．4不同浓度SNP处理BGC－823胃癌细胞后培养液中NO浓度的检测运用NO浓度检测试剂盒，检测酶标仪波长550nm处吸收值并计算NO浓度。结果表明，培养液中NO浓度随着SNP浓度的增高而增高。

2．5不同浓度SNP处理胃癌细胞SGC－7901后培养液中NO浓度的检测运用N0测试盒，检测酶标仪波长550nm处吸收值并计算NO浓度，结果表明，培养液中NO浓度随着SNP浓度的增高而增高。

2．6不同浓度SNP处理正常胃粘膜细胞GES－1后培养液中NO浓度的检测运用NO测试盒，检测酶标仪波长550nm处吸收值并计算NO浓度。结果表明，培养液中NO浓度随着SNP浓度的增高而增高。

3讨论

研究表明，通过基因敲除技术将一氧化氮合成酶敲除后，小鼠因一氧化氮合成酶表达缺失而在胚胎时期死亡。NO合成酶的每个异构体在不同组织选择性发挥不同生物学功能。如eNOS基因敲除小鼠表现出严重的高血压，主要是因为特定表达的上皮细胞中的eNOS在血管形成、增殖中起重要作用。而iNOS缺乏的小鼠容易感染疾病，且在巨噬细胞抵御病原体与肿瘤细胞侵袭中显得功能异常。nNOS基因表达异常容易导致神经系统发育及信息传递方面的缺陷。可见一氧化氮合成酶的正常表达与机体生理和病理学功能正常实现有密切联系。但是一氧化氮在细胞功能学方面的作用一直未能彻底阐明，且有些结论相互矛盾。如有研究表明，外源性供体产生的NO对细胞有毒性作用，容易诱导细胞进入凋亡。但是也有结果显示，NO可能对细胞起保护作用。如肿瘤细胞获得性表达iNOS后，在体外实验中发现其可诱导免疫细胞进入凋亡，或许这也是其逃避免疫系统监督的机制之一。本研究利用SNP供体研究外源性NO对两株胃癌细胞及正常胃粘膜细胞增殖的影响。结果显示，外源性NO对正常胃粘膜细胞和胃癌细胞均有抑制作用(P＜0．05)，且随着NO浓度的增高其抑制作用逐渐增强。综上所述，外源性NO对正常胃粘膜细胞和胃癌细胞的增殖具有抑制作用。

作者：解亚丽乔金婉于冬悦赵婧刘永年杨生玺苏占海单位：青海大学研究生院中国药科大学青海大学医学院基础医学部