高效液相色谱实验教学改革思考范文

摘要：

高效液相色谱法是药物分析的重要方法之一，也是中药制剂分析课程中一项实践性很强的教学内容，其中如何更好地使用高效液相色谱仪进行实验教学，提高学生的自主学习能力以及科研创新能力显得极为重要。在传统高效液相色谱课程教学的基础上，以研究问题为中心，开设综合性、设计性的实验，由浅入深的进行了与高效液相色谱相关的实践教学改革。在激发学生的科研兴趣以及提升大型仪器实验教学的整体质量和水平方面，取得了良好的效果。

关键词：

高效液相色谱；设计性；综合性；实验教学

随着科学技术的突飞猛进和国家经济建设的快速发展，高效液相色谱作为一种重要的分离分析技术，需求和应用越来越广泛[1]。国家对高等教育的投入日益增大，高校的办学规模、教学质量和基础设施建设都有了明显的改善和提高[2-5]，同时对实验设备的经费投入也逐年增加，各高校也相继添置了大量大型仪器设备，实验教学和科研条件都有了极大的改善。其中在药学相关专业中应用最广、使用频率最高的是高效液相色谱仪。针对如何充分利用现有仪器，如何有效的提高大学生运用大型仪器进行科学研究的自主创新能力，以及建立系统的、渐进的实践教学新体系成为当前高校实验教学的主要目标。高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChro－matography，HPLC)技术始于20世纪60年代末期，是以气相色谱和经典液相色谱法为基础的新型分析技术[6]。高效液相色谱具有分辨率高、速度快、分析精准等优点，从而使其在药物分析研究中对于物质的分离和分析占据越来越重要的作用，成为目前医药行业研究中的一种重要分析手段，也是各大高等学校药学等相关专业药物分析课程中的一个重点内容。近年来，由于素质教育的提出社会的需求不仅仅看重学生的知识及学习能力等，对学生的实际动手能力更是越来越看重，这使得实验教学的重视程度提高到了一个新高度，尤其是高效液相色谱仪等大型贵重仪器的理论及实验教学引起了各高等学校的普遍关注和高度重视[7]。在HPLC的实验教学方面，许多高校由于设备条件、实验室经费以及实验技术人员水平等方面的限制，使HPLC的实验教学受到较大的影响，只能做简单的演示实验，本科生基本没有个人接触、操作相应的实验设备的机会。

为改变这一现象，我校实验教学中心从实验设备、人员配备及教学内容与方法等诸多方面对高效液相色谱的实验传统教学做了改进。以研究问题为中心，开设相关专业的综合性的，自主设计性实验选修课及设计性实验，不仅能够让学生独立思考、设计实验以及处理问题，还能够让学生真正的操作运用该仪器并熟练的掌握。实践表明，新的实验教学方式使得学生能够全面地了解实验的内容，使学生能够根据实验数据结果对自己的进一步研究做出相对比较合理的判断与推理，为学生在创新课题的申报及毕业实习打下了良好的基础。

1高效液相简介

高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点：①高压；②高效；③高灵敏度；④应用范围广；⑤分析速度快、载液流速快。高效液相色谱法按分离原理可分为离子色谱、吸附色谱、分配色谱、亲和色谱、体积排阻色谱[8]。根据两相极性差异，又可将其分为正相色谱与反相色谱。高效液相色谱法是目前应用最为广泛的方法，也是药物分析及实验教学中最常采用的方法，其中最为常用的是反相高效液相色谱法，即采用极性流动相和非极性固定相对样品进行分析的方法。高效液相色谱仪主要包括进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等五大系统。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等。

2高效液相色谱实验在传统的实验教学中存在的问题

高效液相色谱法是分析分离混合物最有效的方法，被广泛应用于各个领域，在医药学领域更为看重，占据药物分析的主导[9]。高效液相色谱相关课程的理论性和实践性很强。相对于一般的色谱实验该仪器分析理论性相对较抽象，仪器结构更加复杂，并且在其理论的学习中涉及的相关学科较多。在该仪器的实践教学方面，首先是目前在实验教学方面教育教学方法比较单一，具体以教师的传授-强化-记忆的过程为主的填鸭式的传统教学，即“以教师为中心”的教师讲学生听。这种教学模式不利于培养适合当今快速发展的科学技术人才，也不能培养具有创新精神和实践能力的人才，难以保证教学的质量与效率；其次是理论课程的教学与实际实验的相脱节，仪器分析实验在诸多高校里的实验课程多数是以演示型或验证型实验为主，从而学生只要按实验讲义的内容按部就班的进行实验，不必也不会主动的利用理论课堂的知识来完成实验，其结果是学生动手不动脑，时间一久也就对接触到的仪器相关知识忘记的一干二净；再有目前各大高校在实验教学方面仪器较少，相关仪器的教学课程也相对较少，因此学生接触的机会也就相对较少。并由于学校的扩招，每个实验组的学生人数大约二十几人，造成学生多仪器少的现象，因而不利于每个学生亲自动手学习。同时也会使一些较为懒散的学生产生能不做就不做的想法，这样的仪器分析实验课则会变成“参观仪器”；最后因分析仪器的更新在很短的时间内就有很大的突破，而HPLC的使用与功能的开发和科研结果有着非常密切的关系，HPLC的教学体系未能跟上分析仪器的发展，因此HPLC仪器基础理论教学和实验教学急待完善、充实、深化与提高[10-12]。

3高效液相色谱实验在实验教学中的应用与改革

目前很多高校内都置办了诸多的大型仪器设备，如高效液相色谱仪这类大型的精密仪器，如何让学生接触并且掌握其原理和使用方法，开设实验课则变成了整个过程的关键。但传统教学中往往是学生按照实验讲义的具体步骤做，只是动手不动脑。如何让学生完成该从文献调研、实验设计、复杂样品前处理、柱子与流动相的选择，方法学的考察，结果分析等环节建立完整的仪器的使用与研发，提高学生的科研创新能力是目前各大高校急需解决的一个问题。我校实验教学部根据现有的设备提出了高效液相色谱实验的设计内容，针对传统仪器分析实验的“实验技术路线及方案固定、实验结果已知或固定、规定有限的时间内完成”教学模式。提出以“解决实际问题为中心，开设综合性、设计性实验”，从而有效的提高学生运用现代大型仪器进行科学研究的科研创新能力。为了让同学们充分了解高效液相色谱的相关知识及熟练掌握其操作，我校安排了设计性的实验，其相关步骤内容如图1。为了抓好学生操作的规范性，注重实验过程。实验过程划分为四个部分:系统适应性实验、方法学考察、样品测定、仪器操作及报告：系统适应性实验考核的内容是基本的理论参数概念，诸如理论板数、分离度、拖尾因子等，要求学生通过实验得出的色谱图，计算出其各内容的相关数值，从而加深对HPLC系统适用性的认识与理解。方法学考察分别从线性范围试验、精密度实验、加样回收率实验、稳定性实验和重复性实验等方面考核标准曲线方程、相关系数、线性范围等，这部分实验经过老师指导分析后开始，由学生以小组为单位讨自主设计具体的实验方案。首先通过对样品的前处理、配制对照品溶液、按照已设计的线性范围方案稀释对照品、样品经微孔滤膜过滤后进样、仪器数据处理的峰面积、求出标准曲线方程、相关系数、线性范围；精密度实验，该实验主要考察了学生对精密度概念的理解和掌握；加样回收率试验，在老师的指导下由学生自主设计，采用诸多科研文献的方法设计高、中、低的浓度进行实验。根据线性范围确定中间浓度，比如已确定的线性范围是10~100μg，则其中间浓度设定为50μg，本底值的确定按照《药典》规定：本底与加入的比例1∶1确定样品的本底值，再根据线性范围确定各浓度的加入值；样品的测定实验考核的是学生根据数理统计学对数据的处理和计算，已达到对数据处理的规范性与合理性。而仪器操作及报告部分考核的是学生对实验的预习以及查阅相关的文献资料，再有就是实验过程中的记录和实验报告部分，规范其记录的内容和形式，从而强调原始记录的重要性。通过这四部分考核，要求学生注重实验的具体操作过程，在实验中培养学生严谨的逻辑思维和使用HPLC仪器的方法。

3.1具体的实验-HPLC法测定复方丹参滴丸中丹酚酸B的含量

3.1.1实验目的的确定和方向的选择目前《中药制剂分析》实验课程在高效液相色谱教学中选取的供试品多为原药材，改革后实验选取的待测样品是现代中药制剂新剂型的成药制剂复方丹参滴丸，复方丹参滴丸(FufangDanshenDiwan)是根据《中国药典》2010版一部复方丹参片的处方，在现代高科技条件下提取丹参、三七的有效成分再加入适量冰片而制成的新型纯中药滴丸剂，其药理作用为活血化瘀，理气止痛，用于气滞血瘀所致的胸痛，心前区刺痛，临床上用于治疗胸中憋闷、心绞痛。随着研究的深入，复方丹参方的物质基础及作用机制也逐渐明晰，其主要成分是丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R、龙脑、异龙脑等。在2010版《药典》中对复方丹参片和复方丹参颗粒的含量测定都有关于丹酚酸B的方法，但是对于复方丹参滴丸中相关含量测定却没有提到丹酚酸B的测定[13]，现代药理研究表明丹酚酸B是丹参水溶性物质中活性最强的成分，具有抗氧化、清除自由基、抑制细胞凋亡等多方面的药理作用，同时对心、脑、肝、肾等多个器官具有保护作用[14]。因此建立可行的分析方法用于测定复方丹参滴丸中丹酚酸B的含量具有重要的意义，选择这个实验用于高效液相相关的实验教学改革，对我校学生的综合能力、创新能力和独立思考能力及交流合作能力的培养都将会有非常大的帮助。

3.1.2实验方案的确定以及实验内容的安排在老师的指引下，由学生和老师共同探讨确定实验的方向，提出相关的问题。让学生带着问题查阅一定的文献资料，初步建立实验方案；接着在老师的监督下以小组为单位进行相互的讨论，总结查阅文献和整理过程中的一些问题，及提出一些自己的见解，在老师的指导下建立初步的实验方案；随后让学生带着未解决的问题查阅相关资料，进行第二次讨论，最后确定最终实验方案。最后确定的实验流程见图2。

3.1.3实验具体内容

3.1.3.1实验的前期准备查阅相关文献资料，设计试验方法，准备试验所需仪器与试剂和药品。Softa单泵液相色谱仪，紫外检测器；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为超纯水。复方丹参滴丸（天津天士力公司）；丹酚酸B对照品。

3.1.3.2液相条件的选择流动相和测定波长的选择：经查阅文献参考流动相有以下几种，甲醇-乙腈-甲酸-水=30∶10∶1∶59、甲醇-0.2%磷酸水溶液=40∶60、乙腈-0.05%磷酸水溶液=25∶75；测定参考波长为280nm、283nm、286nm；流速1.0ml/min，柱温室温。参考以上条件选择最佳的流动相和测定波长。最后确定最佳的流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液=25∶75，最佳波长为280nm，柱温为室温。

3.1.3.3供试品提取条件的选择选择提取溶剂：纯甲醇、75%甲醇、50%甲醇、水；提取方法：纯加热回流、超声处理（功率300w，频率50khz）；提取时间：20min、30min、40min。对以上条件做正交试验，选取最佳供试品提取条件为75%甲醇超声处理，提取时间为30min。

3.1.3.4对照品和供试品溶液的配制准确称量对照品1mg于10ml容量瓶，用75%甲醇溶解并定容至刻度，配制成0.1mg/ml的对照品溶液；准确称量0.2g的复方丹参滴丸样品，于25ml容量品，加大约20ml75%甲醇，密塞，超声提取30分钟，放冷，定容得供试品溶液。对照品与供试品的色谱图见图3。

3.1.3.5方法学考察a.线性范围考察：分别用手动进样器进5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、125μg/ml、250μg/ml的对照品溶液20μl，记录色谱图，以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，做线性回归。进样量在0.050~0.250μg范围内与峰面积呈良好线性关系，得到的线性方程为Y=10440X-67963，其R2=0.9999.（n=6）b.精密度试验：取同一对照品溶液，连续进样6次，每次20μL，记录丹酚酸B的峰面积，计算RSD值。最后得丹酚酸B峰面积的RSD值为0.53%。c.重现性试验：取复方丹参滴丸供试品溶液，连续进样6次，每次20μl，记录供试品中丹酚酸B的峰面积，计算RSD值为1.06%。d.稳定性实验：取供试品溶液，每隔2小时进样一次，共测定6次，峰面积RSD=0.91%（n=6），结果表明，样品溶液在12h内稳定，故用于实验教学是一个较为合理的选择。e.加样回收率实验：准确称取已知丹酚酸B含量的样品9份，分别加入高、中、低量的对照品各3份，测定溶液中丹酚酸B的含量，计算回收率。

3.1.3.6样品含量的测定取复方丹参滴丸样品溶液3份，平行测定其含量，求取平均值，最后得复方丹参滴丸中丹酚酸B的含量为0.36%。

3.1.4实验结果汇总实验完成后，老师组织参与实验的同学进行实验汇报，总结交流心得，并以PPT、实验报告等形式上交实验结果，同时记录在整个实验过程出现的问题、心得以及体会，规范实验记录的内容和形式，强调原始记录的重要性。通过对实验结果的总结和分析，培养学生严谨的逻辑思维以及分析问题、解决问题的能力。

4结语

以研究问题为中心，开设综合性、设计型实验，提高本科生的科研创新自主学习能力。结合高效液相色谱实验，教会学生“提出问题→分析问题→解决问题”的系统学习方法，培养学生系统全面的分析解决问题的能力；培养相关专业学生的使用高效液相色谱仪的实践动手操作能力，使学生在进入实习后可以独立操作高效液相色谱仪；通过总结分析实验结果，提高学生的分析问题及解决问题的能力，并且定期在全校范围内开展与高效液相色谱仪的相关汇报与学习交流，形成浓厚的学术交流气氛。通过本项实验教学改革，使得高效液相色谱仪在我校能够物尽其用，充分发挥我校培养高素质、高技能人才的作用，提升我校毕业学生的就业竞争力。

参考文献

[1]陈立仁，蒋生祥.高效液相色谱基础与实践[M].北京：科学出版社，2001：4-6.

[2]阮慧，李五一.大型仪器共享管理的实践与探索[J].实验技术与管理，2010，27(9):6-8．

[3]程宝晶，徐良梅，李仲玉，等.大型仪器开放共享的探讨[J].实验室研究与探索，2010，29(7):334-335．

[4]卞宁生，徐铮，李翔，等.教学型大型仪器实验室资源共享平台的构建与管理[J].实验室研究与探索，2009，28(3):288-290．

[5]刁叔钧.高校大型仪器设备共享管理机制的探讨[J].实验技术与管理，2010，27(7):194-196．

[6]王强.高校计算机实验室管理模式初探[A].创新源于实践[M].武汉：华中科技大学出版社，2006：44-47.

[7]张新铭.实验室管理模式的改革与实践[J].重庆大学学报，2001，5:172-173.

[8]盘炜生.计算机实验教学示范中心建设的实践与探索[J].装备制造技术，2007，3:105-107.

[9]徐仲玉，马红梅，吕霞，等.高效液相色谱法的实验教学探讨[J].实验科学与技术，2008，1672-4550.

[10]陈丽华.通过实验教学提高学生的综合素质[J].实验室研究与探索，2003，22(3):12-13．

[11]谢友宝.大型综合性创新实验设计研究[J].实验室研究与探索，2005，24(12):70-71．

[12]李少玲.实施开放实验提高学生素质[J].实验室研究与探索，2006，25(12):1569-1570.

[13]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:中国医药科技出版社，2010:904-907.

[14]赵先，王婧雯，陆杨，等.丹酚酸B药理作用的研究进展[J].西北药学杂志，2015，30(1):107-110.

作者：宋丽丽 王建胜 刘红玥 张玉萍 崔广智 庄朋伟 单位：天津中医药大学实验教学部 天津中医药大学中药学院