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癌细胞论文范文

癌细胞论文

癌细胞论文范文第1篇

1.1结果(1)TUNEL结果:采用凋亡强度进行评判。凋亡细胞胞核内为蓝黑色颗粒。选择表达明显的4个区域,在10X低倍镜下凋亡小体计数,取平均值。凋亡强度分为三级(强阳、阳性、阴性):凋亡小体>7/10×视野为强阳;3~7/10×视野为阳性;<3/10X视野为阴性;强阳和阳性视为阳性。见图2。(2)化疗效果的判断:化疗前测量宫颈肿物大小,最大直径和最大垂直横径乘积表示。化疗结束2周内再次测量。化疗效果以宫颈病灶大小的变化来判断,采用国际抗癌协会(UICC)疗效判定标准,完全缓解(CR)和部分缓解(PR)视为临床有效,无变化(NC)和临床进展(PD)视为临床无效。

1.2统计学处理应用SPSS16.0统计软件进行χ2检验。

2结果

2.1临床治疗结果30例患者中经新辅助化疗后完全缓解为2例,部分缓解17例,无效11例,临床有效率为63.3%(19/30)。

2.2化疗前后ki-67表达的变化表达阳性率分别为:70.0%、36.7%,经χ2检验有显著差异性,χ2=9.462,P<0.05(P=0.024)。见表1。

2.3化疗前后凋亡阳性率的变化凋亡阳性率=阳性/总例数×100%,阳性率分别为:30.0%、66.7%,经χ2检验有显著性差异,χ2=8.098,P<0.05(P=0.017)。见表1。

2.4化疗后不同临床疗效癌组织中ki-67、凋亡表达变化ki-67的阳性率分别为26.3%、54.5%,经χ2检验差异无显著性,χ2=2.391,P>0.05(P=0.122);凋亡阳性率分别为84.2%、36.4%,经χ2检验差异有显著性,χ2=10.188,P<0.05(P=0.001)。

3讨论

宫颈癌治疗以手术为主辅以化疗,化疗的实施有助于治疗结果的提高。Kuzuya[2]通过术前施以顺铂为基础的联合化疗方案治疗Ib-IIb期宫颈癌后再进行根治手术,术后5年生存率有所提高。本实验以顺铂为基础联合用药,经1个周期治疗,癌组织均有不同程度缩小,临床有效率达到63.3%。肿瘤细胞的增殖与凋亡决定了癌组织的进展和治疗后的转归。

现常用增殖细胞核抗原(PCNA)、ki-67、细胞增殖指数和凋亡指数来反映肿瘤细胞的状态。本实验检测了使用新辅助化疗药物前后,宫颈癌组织中ki-67和凋亡指数,讨论新辅助化疗应用对宫颈癌细胞的增殖及凋亡状态的影响。实验表明:使用新化疗方法后宫颈癌组织中ki-67的表达明显降低、细胞凋亡阳性率显著升高,可以表示化疗后宫颈癌细胞的增殖活性明显下降,凋亡数目明显增加,二者共同作用使肿瘤细胞数量减少。我们对比化疗后不同预后组ki-67的表达,结果无显著差异,可以说明化疗后宫颈癌细胞增殖活性的降低与近期化疗效果并无明显相关,但是ki-67表达的下降说明化疗抑制了宫颈肿瘤细胞的增殖。本实验结果显示化疗后宫颈癌细胞凋亡数较化疗前有显著升高,且临床化疗后有效者凋亡阳性率的表达要明显高于无效者,提示化疗后宫颈癌细胞凋亡的增加是影响化疗近期疗效的重要因素。

癌细胞论文范文第2篇

1.1半定量RT-PCR检测VEGF的表达提取RNA方法如下:将50mL细胞培养瓶中细胞达到80%融合时,倒掉培养液,加入1mLTrizol。将培养瓶内Trizol吸取至1mLEP管中,室温静置5min。加入200μL氯仿,剧烈摇晃数次,室温静置5min,11000转/分,4℃离心15min。取上清液加入新1mLEP管中,加入500μL异丙醇后摇晃数次。室温静置10min,11000转/分,4℃离心10min。弃上清液加1mL75%乙醇后混匀。7500转/分,4℃离心5min。弃上清液风干,加入20μL无RNA酶水,58℃加温10min,-70℃冻存。将mRNA逆转录成cDNA,50μL反应体系PCR反应。VEGF(682bp)引物序列:5''''ggctctagatcgggcctccgaaaccat3''''和5''''ggctctagagcgcagagtctcctcttc3'''';β-actin(434bp)引物序列:5''''tgtgcccatctacgaggggtatgc3''''和5''''ggtacatggtggtgccgccagaca3''''。反应条件:95°C变性,30s;VEGF63.5°C退火,27循环,45s;或β-actin57°C退火,25循环,30s;72°C延伸30s。收集PCR产物1.5%琼脂糖电泳。凝胶成像系统半定量分析。以上结果均重复3次。

1.2统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行统计处理,计量指标用(x軃±s)表示,ANOVA方差分析,student-Newman-Keuls检验,方差齐性检验进行显著性检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞毒性活力检测ACC-M和ACC-2细胞在不同浓度的SNAP作用4h后细胞的活力,在0μmol/L~500μmol/L浓度的SNAP作用下,细胞的活力均保持在88%以上(表1)。经浓度100ng/mL的LPS预刺激12h后,用500μmol/L的SNAP分别作用不同时间ACC-M和ACC-2细胞活力,其活力均保持在86%以上。

2.2不同浓度SNAP对ACCs细胞中VEGF的mRNA表达水平的影响半定量RT-PCR的结果表明(图1、图2),在31.25μmol/LSNAP刺激下ACC-M和ACC-2细胞中VEGF的mRNA平均水平显著升高,为2.32±0.10和2.14±0.15,分别是对照组细胞(0μmol/L)mRNA水平的4.14倍和6.90倍,差异有统计学意(P<0.01)。随着SNAP刺激浓度升高,mR-NA水平逐渐回落:62.5μmol/LSNAP仍可明显上调VEGF的mRNA水平(P<0.01),但不及31.25μmol/L的SNAP显著;125μmol/L和250μmol/LSNAP对VEGFmRNA影响差异无统计学意义;而500μmol/LSNAP则显著下调ACCs细胞中VEGF的mRNA水平(P<0.01),仅为基础mRNA水平的0.23倍和0.17倍(表3)。One-WayANOVA检验和Student–Newman-Keuls检验比较31.25μmol/L、62.5μmol/L及500μmol/L浓度组与0对照组mRNA表达差异有统计学意义。

2.3SNAP时间依赖性抑制100ng/mLLPS诱导的VEGF的表达水平随着500μmol/LSNAP作用时间的延长,ACCs细胞中LPS诱导的VEGFmRNA水平显著下降(P<0.01);当500μmol/LSNAP作用4h后,仅可检测到极微弱的VEGFmRNA条带,其mRNA的平均表达水平显著低于LPS诱导12h后SNAP作用0小时组的mRNA水平(表4)。半定量RT-PCR的结果(见图3、图4)。One-WayANOVA检验和Student-Newman-Keuls检验比较其他各时间组与0对照组mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

一氧化氮(NO)是一种极不稳定的生物自由基,其生成依赖于细胞内的一氧化氮合成酶(nitricoxidesynthaseenzyme,NOS)。它能通过传递电子的反应参与机体的氧化还原反应,在生物体内发挥重要生理作用。目前越来越多的研究证实,NO在肿瘤细胞中发挥着双向调节的作用。研究发现,肿瘤微血管内皮细胞和肿瘤基质细胞中NOS的高表达,能抑制肿瘤的生长和局部浸润。而另一些研究表明,NO具有促进肿瘤血管发生和局部侵袭性。不同的NO浓度是其在肿瘤调控中发挥着截然相反作用的主要原因。高浓度的NO在生物体内形成过氧亚硝基(OONO-)和N3O2,能氧化或硝化DNA导致DNA单链断裂、抑制DNA的合成以及核苷酸还原酶的活性,并能抑制体内的磷酸化信号通路的活化促进肿瘤细胞的凋亡。而低浓度的NO被证实与肿瘤微血管发生、肿瘤浸润和转移相关。因此将NO作为肿瘤治疗的重要手段的同时,应充分认识低浓度的NO对肿瘤促进作用。本实验证明NO的供体SNAP对ACCs细胞有着双向调控作用,当SNAP的刺激浓度在31.25μmol/L时能显著上调血管发生相关因子的表达,而当SNAP的刺激浓度在500μmol/L时血管发生相关因子的表达被有效抑制。

大量研究证明,NO诱导的血管发生相关因子的异常表达,在促进肿瘤微血管发生方面发挥着重要的作用。Jenkins等[8]首次报道在人肿瘤细胞中,转入iNOScDNA阅读框后肿瘤生长加速,且伴随着大量微血管的发生。Ambs等的实验证实,在异种种植瘤内NO能诱导VEGF表达增高,促进肿瘤微血管发生。可见在ACC中,相对低浓度的NO可能通过上调VEGF表达来促进肿瘤微血管发生。

癌细胞论文范文第3篇

1.1方法

1.1.1细胞培养人胃癌细胞SGC-7901细胞株和SGC-7901/DDP培养于RPMI-1640培养液(90%)和胎牛血清(10%)、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的混合培养基中,在5%CO2、37℃的温箱培养。SGC-7901/DDP在无药物培养基连续培育7d,然后将顺铂(终浓度800ng/ml)添加到SGC-7901/DDP的RPMI-1640培养基。2~3d进行一次消化传代,使细胞处于对数生长期。

1.1.2彗星实验(singlecellgelelectrophoresis,SCGE)取处于对数生长期的SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞,以0.25%胰蛋白酶消化,用RPMI-1640培养基制备成浓度为1×105个/ml单细胞悬液,台盼蓝染色细胞存活率>90%进行SCGE。取110μl已熔化的0.5%正常熔点琼脂糖浇注到全磨砂载玻片上,4℃固化10min后,依次加入10μl细胞悬液与75μl0.5%低熔点琼脂糖的混合液,4℃固化10min,固化后的玻片沉浸在细胞裂解液中,4℃避光裂解1h。PBS清洗载玻片后用碱性电泳液浸没载玻片4℃避光解旋DNA20min。将电泳仪电压维持25V,电流维持在0.3A,恒压恒流4℃电泳25min,注意避光操作。然后用中和缓冲液(pH7.4)漂洗,用甲醇固定,滴加30μl浓度为20μg/ml的EB染液进行染色。400倍荧光显微镜下紫外光激发显像,随机转动视野拍摄30个细胞的SCGE检测图像,实验独立重复3次[2]。

1.1.3细胞形态学观察通过倒置显微镜下观察SGC-7901和SGC-7901/DDP形态的不同,拍照记录。

1.1.4细胞划痕实验取状态良好的人胃腺癌细胞株SGC-7901和SGC-7901/DDP,胰蛋白酶消化,5×106个/ml制备接种到24孔板,5%CO2、37℃的温箱培养,细胞长成单层后丢弃介质,用灭菌枪头借助无菌尺在每孔的底部中间划一个“十”字伤口,用PBS轻轻清洗3遍,洗去悬浮的细胞,每孔加入2ml的无血清的RPMI-1640培养基培养,分别于0、12、24h在交叉处拍照,利用Imageproplus软件测量划痕的间距,细胞划痕迁移率(%)=(0h划痕的间距-不同时间点的划痕间距)/0h划痕的间距×100%,每次实验做3个复孔,实验独立重复3次。

1.1.5MTT法检测药物的敏感性取状态良好的人胃癌SGC-7901和SGC-7901/DDP,将浓度为7×104个/ml的细胞加入到96孔板中,每孔100μl体积,过夜培育。当达到80%~90%细胞密度,加化疗药物干预,并设置不同浓度(以上每组3个平行孔)48h,同时设置调零孔和无药物孔。顺铂(0.03、0.3、3、30、60μg/ml)、5-氟尿嘧啶(0.1、1、10、100、200μg/ml)、依托泊苷(5、10、20、40、80μg/ml)、表阿霉素(0.01、0.1、1、10、100μg/ml)、多西紫杉醇(5、10、20、40、80μg/ml)、奥沙利铂(5、50、100、200、400μg/ml)。在实验孔加入MTT(5mg/ml)20μl,37℃培育4h,注意避光操作。结束培育,将上清液完全吸去,各孔加入DMSO150μl,振荡15min,使结晶充分溶解。用酶联免疫吸附法在570nm波长检测各孔光密度值(opticaldensity,OD),求3孔的平均值,实验独立重复3次。细胞存活率(%)=(实验组OD平均值/对照组的OD平均值)×100%,同时计算出各类药物的半数抑制率(halfmaximalinhibitoryconcentrationofasubstance,IC50),细胞对不同药物的耐药倍数=SGC-7901/DDP对不同化疗药物的IC50/SGC-7901对化疗药物的IC50。

1.2统计学处理采用SPSS19.0统计软件分析。数据以珋x±s表示,单变量两组之间的比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。

2结果

2.1人胃腺癌细胞株SGC-7901和SGC-7901/DDP的DNA损伤修复能力的差异SCGE的结果是利用CASP软件分析尾长作为DNA损伤与修复的评价指标。人胃腺癌细胞SGC-7901和SGC-7901/DDP的彗星尾长分别为29.71±4.45和20.38±3.48(t=16.67,P<0.05),见图1、2。

2.2细胞形态人胃腺癌SGC-7901细胞显微镜下观察为单层、形状规则、大小均匀、高折射率、细胞边界、核大、圆形或椭圆形;人胃癌SGC-7901/DDP细胞呈不规则、细胞大小不均一、多核、折光度低,见图3。

2.3细胞划痕实验用显微镜测量人胃腺癌SGC-7901和SGC-7901/DDP在0、12、24h细胞划痕的宽度,结果显示:SGC-7901细胞12、24h划痕宽度比SGC-7901/DDP细胞划痕宽度明显缩小(F=77.12,P<0.05),SGC-7901的迁移能力比SGC-7901/DDP的迁移能力强,见图4、5。

2.4胃腺癌SGC-7901/DDP对各类化疗药的敏感性人胃腺癌细胞SGC-7901和SGC-7901/DDP对不同药物的敏感性,顺铂、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、依托泊苷、多西紫杉醇对顺铂耐药株及其亲本细胞SGC-7901的IC50和耐药倍数见表1,SGC-7901/DDP对顺铂耐药的同时对表阿霉素、5氟尿嘧啶、依托泊苷、奥沙利铂也具有不同程度的耐药。

3讨论

目前已有大量的实验致力于对顺铂耐药性的研究,其中DNA的损伤修复作用引起广泛关注,核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair,NER)是DNA修复的重要途径,核苷酸切除修复交叉互补基因1(excisionrepaircross-complementinggene1,ER-CC1)蛋白是顺铂诱导NER中的关键酶,ERCC1是可以识别DNA损伤和断开链间交联的功能,研究表明,ERCC1mRNA和蛋白的过表达使DNA修复能力的增强与临床胃癌患者顺铂化疗疗效呈负相关性。然而,目前对NER能力的检测多用于临床胃癌组织,无法反映肿瘤的生物学行为发生变化所导致的NER的变化,有学者提出外周血淋巴系统与肿瘤细胞携带有同源基因,均具有相同的NER系统。

癌细胞论文范文第4篇

1.1研究方法

1.1.1Westernblot法依照蛋白提取试剂盒说明书进行各细胞株总蛋白的提取,BCA定量试剂盒进行蛋白浓度的测定,样品定量为5g/L,于每条泳道进行上样50μg蛋白,采用12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺进行凝胶电泳,在电压70V条件下经80min电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2h,加入一抗,在4℃条件下孵育过夜。TBST洗膜后,加入二抗室温条件下孵育1.5h,TBST清洗,采用ECL发光,以凝胶显像仪进行显像。采用QuantityOne进行灰度值检测。

1.1.2qRT-PCR法按照RNA分离试剂盒及TRIzol试剂盒说明书步骤提取并纯化各细胞株总RNA,所有RNA样本浓度均稀释至1g/L,依据逆转录及扩增试剂盒说明书规定步骤进行逆转录及扩增。总RNA浓度测定:用DEPC水调零后取1.5μL样品置于ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计测样台上进行测量,对A260/A280值以及浓度进行记录,总RNA样品在A260/A280为1.8~2.0,RNA纯度较高,无DNA、蛋白质等污染,浓度为100~1458.2μg/μL。总RNA完整性检测:取RNA样品1μL,1%琼脂凝胶电泳80V电压电泳20min,EB染色10min,于凝胶成像系统下观察并进行拍照。结果显示5sRNA、18sRNA、28sRNA条带完整,总RNA抽取完整。RT-PCR反应体系为(2×All-in-OneqPCRMix10μL,45×SyberGreen2μL,PrimerF1μL,PrimerR1μL,cDNA2μL,ddH2O4μL),反应条件如下:95℃预变性10min;95℃变性10s、60℃退火20s、72℃延伸10s,45个循环。所有反应均设立复孔,并以DEPC水代替模板,cDNA作为阴性对照。

1.1.3siNDRG1及阴性对照序列转染PANC-1细胞siNDRG1及阴性对照序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。转染前24h取对数生长期细胞,0.25%胰酶消化成单细胞悬液,分别以10×104和20×104/孔接种至24孔板中,对融合达到70%~90%的细胞株进行转染,细胞分3组:空白对照组、siNDRG1组及阴性对照组。对siNDRG1组及阴性对照序列组依照LipofectamineTM2000试剂说明书步骤进行转染,转染48h后按照miRNA提取及分离试剂盒说明书步骤进行总RNA完整性检测,应用紫外线分光光度仪检测RNA溶解光密度值A(介于260~280nm处比值),计算RNA的浓度及纯度,比值为1.8~2.1者可用于进一步实验。采用Westernblot法及qRT-PCR对转染后PANC-1细胞中NDRG1在蛋白水平及mRNA水平表达的转染效率进行检测。并采用Westernblot法及qRT-PCR对PANC-1细胞siNDRG1转染后MMP-7在蛋白水平及mRNA水平表达进行检测。

1.1.4MTT法检测转染后PANC-1细胞增殖取各组PANC-1细胞,按MTT试剂盒操作步骤,以5×103细胞/孔密度接种于96孔细胞培养板内,并设立3个复孔,培养24、48、72、96、120h后,每孔内加入5mg/mLMTT液2μL,继续进行温育4h,弃上清后加入DMSO150μL,进行振荡溶解结晶,比色选择570nm波长,在酶联免疫检测仪上进行各孔光吸收值测定,并重复3次试验,取平均值。

1.1.5流式细胞仪检测转染后PANC-1细胞调亡PANC-1细胞进行转染48h后,取各组细胞,依照AnnexinV-FITC/PI试剂盒说明书步骤进行操作,流式细胞仪AlexaFITC最大激发波长488nm,最大发射波长为509nm,PI-DNA复合物最大激发波长为535nm,最大发射波长为615nm,采用软件CellQuest进行分析。AlexaFITC为X轴,PI为Y轴,每个样本采集为10000个细胞,区分开早期调亡细胞、晚期调亡细胞及继发坏死细胞区,计算出阳性细胞的百分比例,并重复3次试验,取平均值。

1.2统计学处理采用PASWStatistics18.0软件进行统计分析,率的比较采用χ2检验,Westernblot、qRT-PCR及MTT结果采用GraphPadPrism6.0进行单因素方差分析及作图,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1胰腺癌细胞株的Westernblot法检测结果NDRG1(60kDa)在PANC-1、BXPC-3、CAPAN-2、SW1990细胞株中均有表达,低分化细胞(PANC-1)中NDRG1蛋白水平表达较中分化(BXPC-3)及高分化细胞株(CAPAN-2、SW1990)高,差异均有统计学意义(PANC-1vs.BXPC-3:q=3.4,P<0.05;PANC-1vs.CAPAN-2:q=7.23,P<0.01;PANC-1vs.SW1990:q=8.65,P<0.01);MMP-7(28kD)在4种细胞株中表达与NDRG1的趋势一致(PANC-1vs.BXPC-3:q=3.5,P<0.05;PANC-1vs.CAPAN-2:q=9.27,P<0.01;PANC-1vs.SW1990:q=10.58,P<0.01)。

2.2各细胞株的qRT-PCR检测4组细胞株中NDRG1及MMP-7在mRNA水平均有表达,低分化细胞(PANC-1)中NDRG1在mRNA水平表达较中分化(BXPC-3)及高分化细胞株(CAPAN-2、SW1990)高,差异均有统计学意义(PANC-1vs.BXPC-3:q=3.15,P<0.05;PANC-1vs.CAPAN-2:q=9.35,P<0.01;PANC-1vs.SW1990:q=9.95,P<0.01);MMP-7的mRNA在4种细胞株中表达趋势与NDRG1一致(PANC-1vs.BXPC-3:q=3.27,P<0.05;PANC-1vs.CAPAN-2:q=8.66,P<0.01;PANC-1vs.SW1990:q=9.17,P<0.01)。

2.3Westernblot及qRT-PCR对siNDRG1转染效果的检测Westernblot与qRT-PCR结果显示,siNDRG1转染组PANC-1细胞NDRG1蛋白与mRNA表达水平均明显低于空白对照组(均P<0.05),但阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义(均P>0.05)(图3)。

2.4siNDRG1转染后MMP-7蛋白与mRNA表达变化Westernblot结果显示,siNDRG1转染组PANC-1细胞MMP-7蛋白与mRNA表达水平均明显低于空白对照组(均P<0.05),但阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义(均P>0.05)(图4)。2.5MTT检测siNDRG1干扰后PANC-1细胞增殖变化空白对照组、siNDRG1转染组与阴性对照组PANC-1细胞增殖率72h:(62.53±9.45)%、(42.26±10.24)%、(59.87±6.19)%;96h:(83.26±6.47)%、(51.39±11.29)%、(79.98±7.04)%;120h:(84.67±7.12)%、(61.57±4.38)%、(81.43±7.84)%。siNDRG1干扰后PANC-1细胞增殖能力受到抑制,在72、96、120h与空白对照组比较,差异均具有统计学意义(t=9.454,P<0.01;t=12.367,P<0.01;t=3.733,P<0.05),而阴性对照组与空白对照组在各时间点差异均无统计学意义(均P>0.05)2.6流式细胞仪检测siNDRG1干扰后PANC-1细胞调亡变化siNDRG1组、空白对照组、阴性对照组PANC-1细胞凋亡率分别为17.59%、0.45%、0.24%,siNDRG1组与阴性对照组或空白对照组比较,调亡率明显增高,差异均有统计学意义(均P<0.05),阴性对照组或空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

胰腺癌以发现晚、治疗效果差、预后差及病死率高为特点。经多中心研究显示,胰腺癌的1年生存率低于20%,5年生存率低于5%。80%以上的患者在确诊时已经发生广泛转移。患者均死于癌肿恶性生长、转移及浸润。胰腺导管腺癌在胰腺癌病理分型中占80%~90%[11]。目前无论是手术、放疗及化疗均不能显著提高患者的生存率。针对胰腺癌相关基因靶向治疗是目前的研究热点。胰腺癌的发生及发展是多基因的协同作用的结果。本研究显示,在蛋白水平,NDRG1及MMP-7在PANC-1、BXPC-3、CAPAN-2、SW19904组细胞株中均有表达,在低分化细胞PANC-1中NDRG1在蛋白水平表达较中分化BXPC-3及高分化细胞株CAPAN-2、SW1990中高,提示,NDRG1及MMP-7可能参与恶性肿瘤细胞的生长及分化行为,NDRG1及MMP-7表达上调会导致胰腺癌细胞分化程度差,恶性度增高。在mRNA水平,NDRG1及MMP-7在PANC-1表达较BXPC-3及CAPAN-2、SW1990中高,提示NDRG1及MMP-7对胰腺癌细胞分化及恶性生长行为的调节在基因水平即已发生。NDRG1作为α/β水解酶,具有磷酸泛酰巯基乙胺序列,能够活化氨基酸及脂肪酸,在细胞生长分化及细胞周期中起到重要作用,参与肿瘤细胞的蛋白水解代谢,从而促进肿瘤细胞的分化潜能,细胞周期从G1期向G2期转化。NDRG1没有水解酶的催化位点,受N-myc的抑制。NDRG1位于人染色体8q24,全长约60kb,包含着16个外显子及15个内含子,C末端包含3段特有的具有10个亲水性氨基酸残基串联重复序列。基质金属蛋白酶作为蛋白水解酶家族,在肿瘤形成微环境中起到重要作用。

本研究采用siRNA转染胰腺癌PANC-1细胞株,经Westernblot及qRT-PCR在蛋白及mRNA水平证明沉默效率达到60%以上,成功的下调了NDRG1在PAN-1细胞中的表达。NDRG1下调后,经Westernblot及qRT-PCR检测发现,MMP-7在蛋白及mRNA水平表达下调[10]。NDRG1对恶性肿瘤生长分化等恶性行为的调控可能通过调控MMP-7表达实现,MMP-7可与NDRG1的辅基酰基载体蛋白结合形成复合体从而影响恶性肿瘤的行为,NDRG1也可能上调MMP-7表达从而通过水解活性促进胰腺癌细胞从原发灶脱落、迁移,在远隔器官种植浸润。MMP-7以酶原形式产生,激活后即形成IV型胶原酶,从而降解、破坏靠近肿瘤表面细胞外基质中I型、III型胶原,诱发肿瘤细胞沿缺失的基膜环形侵润,结果即为恶性肿瘤细胞的侵袭转移[18]。MMP-7可以与NDRG1的辅基酰基载体蛋白结合,两者以复合体形式存在并激活,从而影响胰腺癌的生长分化、凋亡增殖等恶性行为。

癌细胞论文范文第5篇

1.1实验分组按事先转染的成分不同以及后续培养基不同分为先行PLK-1siRNA干扰然后在无叶酸培养基中培养72h组(Null+PLKS组)、先行PLK-1siRNA干扰然后在正常叶酸浓度培养基中培养72h组(Control+PLKS组)、无PLK-1siRNA而用PBS作对照的转染然后在无叶酸培养基中培养72h组(Null+PBS组)、无PLK-1siRNA而用PBS作对照的转染然后在正常叶酸浓度培养基中培养72h组(Control+PBS组)。

1.2实验方法

1.2.1PLK-1siRNALipofectamineTM2000的转染转染过程严格按照说明书施行。其基本步骤为:转染前24h,在每块6孔板的每个孔内用2mL不含双抗的RPMI1640培养基接种对数生长期的肿瘤细胞5×105个。经过24h,细胞融合度为40%。用250μLOpti-MEM培养基稀释siRNA(siRNA的量为100pmol),混匀。用250μLOpti-MEM稀释5.0μLLipofectamineTM2000,混匀,室温下静置5min。将以上混合转染试剂和siRNA稀释液混匀,室温下静置20min。转染复合物加入到6孔细胞板中,前后轻摇细胞板混合均匀。转染6h后换新鲜培养基。

1.2.2Real-timePCR和Westernblot验证PLK-1siRNA干扰的效果细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h,然后用RIPA和Trizol分别提取蛋白和RNA。蛋白以GAPDH为内参,用Westernblot检验其表达差别。siRNA经反转录成cDNA后行Real-time检测PLK-1siRNA的转录水平差别。PLK-1和GAPDH的引物由上海生工合成,引物序列见表1。

1.2.3CCK-8检测细胞增殖情况经不同PLK-1siRNA干扰或者PBS作为对照的干扰组,6h后,胰酶消化收集细胞,将其按96孔板每个孔2000个细胞的密度接种,每次取5复孔,按4组要求分别加入正常叶酸浓度的培养基和不含叶酸的培养基后,分别培养72h,然后弃去培养基,分别加入上述对应的培养基100mL和CCK-810μL的混合液,在培养箱内孵育3h,检测吸光度,观察细胞增殖情况。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡和增殖情况在6孔板转染后,经不同PLK-1siRNA干扰或者PBS作为对照的干扰组,干扰6h后吸去干扰液,按4组要求分别加入正常叶酸浓度的培养基和不含叶酸的培养基,培养72h。收取上清液中的悬浮细胞+胰酶消化后的细胞,离心,PBS洗2次。然后按AnnexinV试剂盒操作流程染色。实验总共设一个阴性对照管、AnnexinV和PI单染管和实验管,每管细胞约1×106。室温避光孵育15min,流式上机检测细胞凋亡情况。对于周期,收集的各组细胞加入70%(PBS稀释)-20℃无水乙醇2~3mL,4℃固定6h以上。1500r/min去上清,1mLPBS1500r/min5min清洗1遍,加入200μLPBS重新悬浮,调整细胞浓度为106~107,加入1%的Rnase60μL,37℃摇床水浴30min。加入20μL250μg/mL的PI,室温避光孵育10min上机检测。

1.2.5Westernblot检测Bcl-2表达情况RIPA提取蛋白后,BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物研究所)测定蛋白浓度,调整浓度后用SDS上样缓冲液加热变性后,蛋白电泳检测蛋白表达差异。

1.3统计学方法使用SPSS19.0软件包进行统计处理。所有结果用均数±标准差(x珋±s)表示。各组间差异比较使用析因方差分析,多组间均数比较采用F检验,均数间的两两比较采用q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组PLK-1mRNA水平和蛋白表达情况转染72h后检测PLK-1mRNA和蛋白的表达情况。Real-timePCR检测发现胃癌细胞系SGC7901和BGC823,PLK-1mRNA在用PLK-1siRNA干扰的PLKS组较PBS干扰的PBS组明显降低,见图1。同样,在蛋白表达水平上,Westernblot显示经PLK-1siRNA干扰,胃癌细胞系SGC7901和BGC823的PLK-1蛋白水平也明显降低,见图2及图3。

2.2各组SGC7901和BGC823细胞增殖情况比较在接种相同数目细胞的前提下,细胞数目少反映PLKS组细胞增殖较慢。析因方差分析显示叶酸缺乏和PLK-1siRNA对SGC7901和BGC823细胞增殖均有明显影响,且叶酸缺乏和PLK-1siRNA对胃癌细胞系SGC7901和BGC823有交互作用(P值分别为0.046和0.006)。因Null-PLKS组均数<Null-PBS组均数+Control-PLKS均数-Control-PBS组均数(SGC7901和BGC823细胞系计算值分别为0.227<0.316和0.309<0.485),所以叶酸缺乏和PLK-1对胃癌细胞系SGC7901和BGC823的增殖抑制具有协同作用。

2.3各组SGC7901和BGC823细胞凋亡情况比较AnnexinV检测细胞凋亡情况,流式图横坐标为标FITC的AnnexinV,纵坐标为PI。SGC7901的早期凋亡(Q4象限)在Null-PLKS组、Null-PBS组、Control-PLKS组和Control-PBS组分别为(26.42±1.50)%,(5.13±1.24)%,(10.17±1.76)%和(6.17±2.47)%。BGC823的早期凋亡(Q4象限)在Null-PLKS组、Null-PBS组、Control-PLKS组和Control-PBS组分别为(24.28±2.90)%,(6.88±2.05)%,(13.30±2.58)%和(5.80±3.01)%。析因方差分析得出,PLK-1siRNA能促进凋亡,但叶酸缺乏对凋亡影响不大;叶酸缺乏与PLK-1siRNA之间有交互效应。因Null-PLKS组均数<Null-PBS组均数+Control-PLKS均数-Control-PBS组均数(SGC7901和BGC823细胞系计算值分别为:26.42>9.13和24.28>14.38),所以叶酸缺乏能增强PLK-1对胃癌细胞系SGC7901和BGC823的促凋亡作用。

2.4各组SGC7901和BGC823细胞周期情况SGC7901G2/M比例在Null-PLKS组、Null-PBS组、Control-PLKS组和Control-PBS组分别为(20.88±2.55)%,(8.32±2.18)%,(19.49±1.98)%和(7.48±1.68)%;BGC823G2/M比例在各组分别为(22.95±2.71)%,(11.61±2.66)%,(22.01±2.94)%和(10.03±2.47)%。对数据进行统计,发现PLK-1siRNA能提高G2/M比例(P<0.05),但叶酸缺乏不能,而且叶酸缺乏和PLK-1siRNA之间也无交互作用(P>0.05)。见图6及图7。

2.5各组SGC7901和BGC823细胞Bcl-2蛋白表达情况叶酸缺乏和PLK-1siRNA均能降低Bcl-2的表达,而且叶酸缺乏和PLK-1siRNA对BCL-2的表达有交互效应(P<0.05)。鉴于两者Null-PLKS组均数>Null-PBS组均数+Control-PLKS均数-Control-PBS组均数,叶酸缺乏和PLK-1siRNA具有拮抗作用。

3讨论

肿瘤是一个全身性疾病,手术对肿瘤尤其是中晚期肿瘤其是胃癌治疗效果有限。基于肿瘤发生、发展机制的综合治疗,尤其是联合治疗有其特有的优势。PLK-1作为PLK家族中被研究最多的一员,不仅在很多肿瘤中表达升高,而且它的升高还对诸如胃癌、结直肠癌的预后判断具有价值。PLK-1参与了数个至关重要的有丝分裂步骤,如激活CDC25c磷酸化酶、调节有丝分裂过程等。PLK-1具有参与多个肿瘤发生、发展步骤的特点。所以,PLK-1被认为是重要的分子靶标,并被广泛关注。Bcl-2是一个经典的抗凋亡蛋白,降低Bcl-2能促进肿瘤凋亡,抑制肿瘤生长。本实验运用PLK-1的siR-NA敲低PLK-1后,胃癌细胞系SGC7901和BGC823的增殖降低,凋亡增加,细胞阻滞在G2/M期,且叶酸缺乏联合PLK-1siRNA能抑制Bcl-2的表达,提示降低PLK-1可能通过Bcl-2途径起作用,这与其他研究的结果类似。叶酸是生物体代谢重要的一碳单位,叶酸类似物如甲氨蝶呤被用作肿瘤的治疗。本研究证实PLK-1siRNA能抑制胃癌细胞增殖,促进细胞凋亡,叶酸缺乏也能抑制肿瘤的增殖,且叶酸能协同PLK-1siRNA抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡。但在抑制胃癌细胞Bcl-2的表达上有拮抗作用。

癌细胞论文范文第6篇

1.1实验方法

1.1.1MTT法检测华蟾素对宫颈癌HeLa细胞生长的影响根据参考文献提供方法[6-7],将宫颈癌HeLa细胞培养至对数生长期,调整其细胞密度后接种于96孔细胞培养板中,200μl/孔,分组为:调零孔组(只含RPMI1640培养液,无细胞)、对照组(含RPMI1640培养液、细胞)、华蟾素组(浓度分别为1、10、100、1000μg/ml),待细胞贴壁后加入药物,其中对照组加入等体积的培养液,然后置于细胞箱内继续培养24、48、72h后弃掉上清,加入MTT(5mg/ml)20μl/孔,继续于细胞培养箱中培育4h后,每孔加入200μlDMSO,在振荡器上震荡使结晶充分溶解。用酶标仪检测各孔的吸光度值(OD,其中波长为570nm),按以下公式计算细胞的增殖抑制率:抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

1.1.2流式细胞术检测华蟾素对宫颈癌HeLa细胞周期的影响宫颈癌HeLa细胞培养至对数生长期,将细胞用胰酶消化后,重新接种,分组同步骤1.3.1,其中药物组每组加入华蟾素(浓度分别为1、10、100、1000μg/ml),对照组加入等体积培养液,培养48h后收集细胞,用固定液固定细胞过夜后,离心弃上清,PBS洗涤,用含0.1%TritonX-100、50μg/mlRNAse的PBS混合液将细胞重悬,加入90μlPI(0.5mg/ml)避光孵育半小时后,用尼龙网过滤,然后流式细胞仪进行检测分析。

1.1.3划痕实验检测华蟾素对宫颈癌HeLa细胞侵袭能力的影响根据参考文献划痕实验方法[8],将宫颈癌HeLa细胞接种于6孔细胞培养板中,分组为:对照组以及药物华蟾素组(10、100、1000μg/ml)。将细胞于细胞培养箱中培养24h后,用20μl加样枪头于细胞层中竖向划一宽度均匀、一致的细胞伤口模型,每孔划3条伤口,然后药物组加入含有相应浓度的华蟾素培养液,而对照组加入等体积培养液,分别在细胞培养箱中孵育0、24、48h后,于光学显微镜下测算各划痕的宽度(每条划痕各取3个固定位置计算距离,取其平均值)。细胞迁移能力以迁移率表示:细胞迁移率=(原划痕宽度-现划痕宽度)/原划痕宽度×100%。

1.2统计学方法应用SPSS13.0统计软件分析,所有数据均用(珋x±s)表示,行单因素方差分析、重复测量方差分析以及t检验。

2结果

2.1华蟾素抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖MTT法测定结果示:当1、10、100、1000μg/ml华蟾素作用于宫颈癌HeLa细胞24、48、72h后,可见细胞生长显著变缓。且随着华蟾素药物浓度的增加以及作用时间的延长,这种抑制作用有增强趋势,具有时间、剂量效应关系,各药物组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2华蟾素对宫颈癌HeLa细胞周期的影响流式细胞术结果示:当1、10、100、1000μg/ml华蟾素作用于宫颈癌HeLa细胞48h后,与对照组相比较,华蟾素各浓度组G0/G1期细胞所占比例不断增加,S期细胞比例减少,G2/M期细胞比例无显著变化,各药物组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3华蟾素抑制宫颈癌HeLa细胞的迁移细胞划痕实验结果示:当10、100、1000μg/ml华蟾素作用于宫颈癌HeLa细胞24、48h后,划痕宽度均大于对照组,通过上述公式计算各组细胞的迁移率发现:华蟾素组作用于宫颈癌HeLa细胞24、48h后,迁移率均小于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),见表3。显示药物华蟾素对宫颈癌HeLa细胞的迁移有一定的抑制作用,能够降低宫颈癌HeLa细胞向远处转移的能力。

3讨论

随着医学技术的发展,传统中医药材逐渐成为当今治疗肿瘤的重要手段以及新的策略之一,中药材的优势主要在于不仅对肿瘤具有显著的抑制作用,不易产生耐药性,且对机体的损伤以及不良反应小。因此,研究中药材抗肿瘤效应具有广阔的临床应用价值。华蟾素系传统中药中华大蟾蜍皮的水制剂,其主要成分是蟾毒灵及吲哚生物碱等,具有消炎、止痛、抗肿瘤以及提高宿主免疫力等多种作用。近年来研究表明,华蟾素对如乳腺癌、骨肉瘤、前列腺癌等多种肿瘤细胞具有抑制作用并可诱导其凋亡。且动物实验显示华蟾素具有升白细胞的作用,具有安全有效、不良反应小的优点,已被广泛应用于多种肿瘤的辅助治疗。但是其对于宫颈癌的作用还未见有相关文献报道,因此,我们进行了相关研究,希望为华蟾素在宫颈癌的临床应用提供一定的理论依据和基础。

本实验用不同浓度的华蟾素作用于宫颈癌HeLa细胞后,通过MTT法观察发现,华蟾素作用于宫颈癌HeLa细胞后,可显著抑制细胞的生长,且对细胞的抑制作用随着药物浓度的增加及作用时间的延长而逐渐增强,这说明华蟾素对HeLa细胞生长的抑制作用具有一定的量效、时效性,表明华蟾素可显著抑制HeLa细胞的增殖。我们通过流式细胞术结果发现,不同浓度华蟾素作用于宫颈癌HeLa细胞48h后,华蟾素各浓度组将细胞周期主要阻滞在G0/G1期,使细胞S期所占比例明显减少,从而抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。而有研究显示,华蟾素能将肿瘤细胞阻断在S期,从而抑制肿瘤的增殖。这表明华蟾素能够通过阻滞细胞周期的进展进而发挥其抗肿瘤效应,但对不同类型肿瘤细胞周期的具体机制还有待深入的研究和探讨。另外,华蟾素还可抑制宫颈癌HeLa细胞的迁移能力。

癌细胞论文范文第7篇

1.1细胞培养从液氮罐中取出冻存的PC3细胞,迅速放入预热的37℃水浴锅中,快速震荡溶化,1000r•min-1离心5min后,将细胞接种于已配制好的含10%FBS和1%L-Gln的DMEM完全培养基中,置于37℃,5%的CO2培养箱中培养.每隔2~3d更换细胞培养液,待其长到铺满皿底80%时传代.依据Friedenstein[11]提出的全骨髓贴壁培养法分离和纯化大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)做为阴性对照组细胞,常规传代培养.

1.2软琼脂克隆

1.2.1软琼脂储备胶的制备下层胶制备:配制1.2%的低熔点琼脂糖,高压灭菌,待其温度降至37℃左右后置于37℃水浴锅备用.取1.5mL1.2%低熔点琼脂糖加入已经配好的1.5mL2×DMEM培养基(含20%FBS+1%Gln),混匀后倒入六孔板中制成软琼脂底板,置于冰袋上待其冷却凝固后备用.上层胶制备:配制0.7%的低熔点琼脂糖,高压灭菌,待其温度降至37℃左右后置于37℃水浴锅备用,取1.5mL0.7%低熔点琼脂糖加入已经配好的约含有1~3×103mL-1PC3细胞的等体积2×DMEM培养基中,混匀后倒入软琼脂底层上,制成双琼脂层,置于冰袋上待其冷却凝固后置于培养箱中培养7~14d左右镜检,观察软琼脂克隆团的形成情况.

1.2.2单细胞软琼脂克隆团的获取软琼脂克隆团形成第14d置于倒置显微镜下观察,标记并挑出较大克隆团后置于细胞培养皿中培养.第3d观察有无贴壁细胞生长,若有则弃去含有琼脂渣的培养基,加入新鲜培养基培养,每隔2~3d更换细胞培养液,待细胞铺满皿底80%~90%时传代;若无贴壁细胞生长则弃去培养皿,重新挑取单克隆团细胞.

1.3乳鼠移植瘤动物模型的构建取对数生长期的实验组细胞PC3和对照组细胞BMSCs,经胰蛋白酶消化后,DMEM完全培养基终止消化,1000r•min-1离心7min,弃上清,DMEM完全培养基重悬细胞,台盼蓝计数后,调整细胞浓度约为2×107mL-1.用1mL注射器吸取0.1mLPC3细胞悬液接种于实验组乳鼠皮下,对照组乳鼠皮下注射0.1mLBMSCs细胞悬液.注射后每天定时观察乳鼠皮下的成瘤情况,用游标卡尺测量皮下肿物的直径,以大于0.5cm为成瘤成功.

1.4病理组织观察和免疫组织化学检测剥离乳鼠皮下产生的肿物,9%福尔马林液固定,组织过夜脱水后,石蜡包埋切片.切片组织经过二甲苯和梯度酒精脱水脱蜡,苏木精染色3~5min,1%HCl分色1~3s,碳酸锂返蓝2min,伊红染色2min,酒精脱水,干燥后中性树脂封片.在光学显微镜下观察组织病理切片形态.免疫组织化学染色按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作:石蜡切片烘烤30min后,二甲苯和梯度酒精脱水脱蜡,柠檬酸盐缓冲液抗原修复5min,PBS冲洗3×3min,3%去离子水孵育15min,PBS冲洗3×3min,滴加试剂A(山羊血清)室温孵育15min,倾去勿洗,滴加一抗(阴性对照组一抗用PBS代替),37℃孵育2h,PBS冲洗3×3min,滴加试剂B室温孵育15min,PBS冲洗3×3min,滴加试剂C室温孵育15min,PBS冲洗3×3min,DAB显色,自来水冲洗,干燥,中性树脂封片.光学显微镜下观察抗体表达部位.

2结果与分析

2.1PC3软琼脂克隆团产生和单细胞克隆团形成PC3接种第7d时软琼脂上产生了较小的细胞克隆团(图1:A),待其长到13d时,形成较大的细胞克隆团(图1:B).选取较大克隆团细胞在液体培养基中分离培养(图1:C,D)后发现,这部分从软琼脂克隆团上挑出的单细胞比未经软琼脂克隆的细胞表现出更强的增殖能力。

2.2乳鼠皮下成瘤18只实验组乳鼠皮下均有直径大于0.5cm的肿物产生,6只对照组乳鼠皮下均无异物产生且生长状态良好.肉眼观察实验组乳鼠发现:注射第2d后乳鼠腋下发红肿胀,触摸质软;第3~4d乳鼠腋下发红完全消失,肿胀部分逐渐变硬,触摸可发现有黄豆粒大小可移动肿物存在(图2:A).第7d乳鼠皮下肿物逐渐增大,触摸质硬(图2:B).第16d之后,部分乳鼠维持肿物大小不变,部分乳鼠肿物开始消退(图2:C).第21d之后,除3只乳鼠皮下存在极小肿物外(图2:D),其余乳鼠肿物均消退.表明在初接种PC3细胞时乳鼠免疫系统发育不完善,肿瘤细胞能够被宿主的免疫系统接受并逃离免疫系统的监控即具有免疫耐受性,使肿瘤在皮下发生并生长.接种16d及之后,有部分乳鼠皮下肿物开始消退,提示此时接种鼠的免疫系统已逐渐发育完全,能够对接种的异质细胞进行免疫监控和杀灭.接种21d后,只有3只鼠皮下存在肿瘤,类似于部分肿瘤存在于人类非免疫缺陷人群中,其余鼠消退证明此时小鼠免疫功能已发育完全.

2.3病理组织变化和CD133表达观察病理组织切片HE染色结果发现:肿物组织内有大片弥漫性分布、紊乱无章排列的肿瘤细胞存在,细胞形态大小不一,核大深染,可见明显病理性不规则核分裂相,为中度不典型增生,病理学上诊断为肿瘤组织(图3:A).免疫组织化学染色结果显示该肿瘤组织表达了前列腺癌干细胞特异性表面标志物分子CD133细胞膜和细胞浆均呈阳性(++)(图3:B).

3讨论

癌细胞论文范文第8篇

1.1小鼠DC细胞分离培养[6-7]断颈处死小鼠,75%酒精中浸泡5min,超净台中无菌取出小鼠的股骨、胫骨,剪去两端,用1mL注射器吸buffer刺入骨髓腔,反复冲洗直至骨发白,200目滤网冲过滤,收集细胞悬液,离心(300g,10min),加入红细胞裂解液,离心去上清,buffer清洗沉淀后再次离心。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞,接种于24孔板(1×106/mL),加入细胞因子GM-CSF50ng/mL、IL-425ng/mL,37℃,5%CO2,进行培养。48h后,弃培养基,PBS清洗1遍,加入新的培养基。之后隔天半量换液。第8天加入LPS继续培养24h,离心收集的悬浮细胞即为DC细胞。

1.2CT26.WT细胞与全T细胞共培养37℃,5%CO2培养的CT26.WT细胞待密度超过80%,胰酶消化,计数待用。T细胞∶CT26.WT(10∶1)进行混合培养,48h后做实验研究。

1.3DC细胞与T细胞共培养腹腔注射第1、15天的DC细胞与对应的T细胞,调至适当浓度至1×106个/mL(DC∶T=1∶10),加入96孔板,100μL/孔,混合培养48h。每组设5个复孔,同时设单独DC细胞孔、单独T细胞孔。刺激能力的计算:(混合孔-单独DC细胞孔)/单独T细胞孔。

1.4B7H4的检测取新鲜的人结直肠癌组织及配对的正常肠上皮组织8对;CT26.WT细胞腹腔注射第15天的BALB/c小鼠,待腹腔成瘤后,取肿瘤组织及配对的正常肠组织1对,IHC检测B7H4的表达;腹腔注射的第0、1、2周,取小鼠肠组织及肿瘤组织,WesternBlot检测组织蛋白B7H4的表达。

1.5统计学方法所有数据采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析、t检验等。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1DC细胞在镜下的细胞形态第8天可见多数细胞呈集落样生长。

2.2腹腔注射不同时间段的全T细胞对CT26.WT的杀伤效应腹腔注射不同时间段(1、3、5、7、9、11、15d)全T细胞与CT26.WT(10:1)混合共培养48h后,CCK8结果示第7天,活细胞数开始略上升,第15天最高(第1天:OD=1.24400±0.25146;第15天:OD=3.05767±0.86557;P=0.000,差异有统计学意义,图2);第1、15天的共培养体系进行细胞凋亡检测:第15天细胞凋亡率降低(第1天:CT26凋亡率8.667±0.4055;第15天:CT26凋亡率3.633±0.4910;P=0.001,差异有统计学意义)。

2.3流式细胞术检测DC细胞表型腹腔注射的第1、15天,DC细胞表面分子MHC-Ⅱ阳性率(79.000±1.9348vs51.000±2.9180)比较,差异有统计学意义。

2.4DC细胞表面分子ICAM-1的表达搜集腹腔注射不同时间段(0d-正常小鼠,1、3、5、7、9、11、15d)的DC细胞,WesternBlot检测ICAM-1的表达。第9天其表达开始下降,第15天最低。

2.5IHC检测B7H4在正常肠上皮(N)和癌组织(T)中的表达WesternBlot检测腹腔注射不同时间段小鼠组织B7H4的表达9对组织(8对人来源的,1对鼠来源的)均显示B7H4在癌组织中表达增高(图5)。腹腔注射第0、1、2周,正常肠上皮组织(第0周)B7H4表达很微弱,第1、2周,腹腔内已有肿瘤形成,肿瘤组织B7H4表达上升。2.6腹腔注射1、15天,DC细胞刺激T细胞增殖能力的比较第1天:2.77±0.017214;第15天:2.33±0.016836;P=0.000,差异有统计学意义。

3讨论

肿瘤免疫机制是一个复杂的网络系统,已有研究发现:B7H4可以抑制T细胞的激活和增殖;TGF-β可以诱导免疫抑制[12];结直肠癌来源的成纤维细胞可以抑制自然杀伤细胞的功能等[13]。1970年,Bretscher和Cohn已证实“协同刺激信号”决定着T细胞免疫的方向,在宿主抵抗外来入侵时至关重要,而T细胞活化的第一信号就来源于APC所提呈的抗原。DC细胞是1973年由Steinman等[14]首先发现的,是目前所知抗原提呈能力最强的APC,而T细胞活化则需要两个信号:第1信号来自DC等细胞提呈的抗原,第2信号则为共刺激分子包括B7/CD28、ICAM-1/LFA-1、LFA-3/CD2等,缺乏任一信号T细胞都不能有效地发挥处理肿瘤细胞的能力。