上皮性卵巢癌基因甲基化研究范文

《中华肿瘤防治杂志》2015年第二十期

【摘要】

目的RAS相关结构域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）启动子区超甲基化介导的基因转录失活在卵巢癌中频见，可作为卵巢癌诊治过程中有意义的分子生物学指标，RAS相关结构域蛋白2A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）与RASSF1A同源，其基因异常甲基化在多种肿瘤发生发展中发挥重要作用。本研究探讨上皮性卵巢癌组织RASSF2A甲基化水平，并分析其临床意义及高甲基化与mRNA表达情况的相关性。方法选择2013－10－01－2014－12－31聊城市人民医院手术治疗的50例上皮性卵巢癌、27例交界性上皮性卵巢肿瘤和20例良性上皮性卵巢肿瘤患者，应用甲基化特异性PCR（MSP）检测卵巢肿瘤组织中RASSF2A基因启动子甲基化状态，采用RT－PCR检测其mRNA表达水平。采用5－氮杂2′－脱氧胞苷（5－aza－dC）对人卵巢癌细胞株SKOV3、3AO进行去甲基化干预实验，并检测药物作用前后RASSF2A基因启动子甲基化及其mRNA的表达情况。结果RASSF2A基因mRNA在良性上皮性卵巢肿瘤中的表达阳性率为95．00％（19／20），交界性上皮性卵巢肿瘤为59．26％（16／27），上皮性卵巢癌组织为34．00％（17／50），表达强度依次下降，差异有统计学意义，χ2＝21．855，P＜0．001。RASSF2A基因启动子在良性上皮性卵巢肿瘤组织中的甲基化率为0（0／20），交界性上皮性卵巢肿瘤为22．22％（6／27），上皮性卵巢癌组织为46．00％（23／50），差异有统计学意义，χ2＝15．474，P＜0．001。RASSF2A甲基化水平与卵巢癌患者的年龄、病理类型、临床分期、组织分化程度及淋巴结转移无明显相关性。RASSF2A基因甲基化与其mRNA的表达呈负相关，甲基化阳性组织的mRNA表达水平明显低于甲基化阴性组织。5－aza－dC药物作用后，卵巢癌细胞株中RASSF2A基因甲基化被逆转，而其基因表达明显升高。结论RASSF2A启动子区高甲基化导致的基因表达沉默与上皮性卵巢癌的发生发展有关。

【关键词】

上皮性卵巢癌；甲基化；RAS相关结构域蛋白2A基因；基因检测

上皮性卵巢癌是女性生殖系统中恶性程度最高和预后最差的肿瘤，其病死率居妇科恶性肿瘤首位［1］。大量研究已证实，RAS相关结构域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）启动子区超甲基化介导的基因转录失活是卵巢癌中的频发事件，可作为卵巢癌诊治过程中有意义的分子生物学指标［2－4］。与RASSF1A具有高度同源性的RAS相关结构域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）异常甲基化在多种肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。本研究通过RT－PCR和MSP方法检测良性上皮性卵巢肿瘤、交界性上皮性卵巢肿瘤和上皮性卵巢癌组织及卵巢癌细胞株中RASSF2AmRNA的表达及其启动子甲基化状态，分析RASSF2A启动子甲基化与其mRNA的表达以及卵巢癌临床病理特征的关系，探讨RASSF2A启动子区甲基化在卵巢癌发生发展中的作用。

1材料与方法

1．1标本来源收集2013－10－01－2014－12－31聊城市人民医院妇产科收治的上皮性卵巢癌患者50例，交界性上皮性卵巢肿瘤27例，良性上皮性卵巢肿瘤20例。所有组织标本均经病理学确诊，所有患者术前均未接受任何放化疗或激素治疗。标本采集在离体后10min内进行，并迅速放入液氮罐保存，后转移至－80℃冰箱保存。上皮性卵巢癌病例中，依据2006年FIGO分期标准，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期31例；依据2003年WHO组织学分类标准，浆液性腺癌24例，黏液性腺癌16例，子宫内膜样癌10例；高分化10例，中分化15例，低分化25例；有淋巴转移27例，无淋巴转移23例；年龄＜50岁者19例，≥50岁者31例。

1．2细胞株卵巢癌细胞株SKOV3和3AO由聊城市人民医院中心实验室提供。

1．3主要试剂Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，DNA甲基化试剂盒购自德国Qiagen公司，引物均由上海生工设计合成。

1．4实验方法

1．4．1细胞培养及药物处理在37℃、5％CO2及饱和湿度的孵育箱中静置培养卵巢癌细胞株，用含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养基及时换液。用终浓度为10μmol／L的5－aza－dC处理卵巢癌细胞株，常规换液，保持上述药物浓度。于药物连续作用72h后收集细胞。

1．4．2RT－PCR检测参照Trizol试剂说明书提取组织及细胞总RNA。测得其浓度及纯度符合实验要求后，取2μL总RNA进行逆转录。所得cDNA经半定量PCR扩增。RASSF2A基因上游序列为5′－GCG－CCTAGAACGTGTTTTTC－3′，下游序列为5′－ACT－AGGCGTCCTCACATTGC－3′，扩增产物长度为563bp。以GAPDH作为内参基因，上游为5′－CAA－CGGATTTGGTCGTATT－3′，下游为5′－CACAGTC－TTCTGGGTGGC－3′，扩增片段长度为166bp。PCR反应条件为95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察实验结果。

1．4．3DNA的提取及亚硫酸盐修饰采用酚氯仿法提取组织及细胞总DNA，并对基因组DNA进行亚硫酸盐修饰，按照甲基化特异性PCR试剂盒说明书进行。所得产物直接用于PCR扩增或保持在－20℃冰箱保存备用。

1．4．4甲基化特异性PCR使用2对引物检测RASSF2A基因启动子甲基化状态。甲基化引物正义链为5′－GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG－3′，反义链为5′－AAAAACCAACGACCCCCGCG－3′，非甲基化引物正义链为5′－AGTTTGTTGTTGTTTTTTA－GGTGG－3′，反义链为5′－AAAAAACCAACAACCC－CCACA－3′，扩增产物长度均为108bp。反应条件为95℃预变性10min，95℃变性30s，58℃复性30s（甲基化）；54℃复性30s（非甲基化），72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。所得产物电泳后摄像，分析结果。

1．4．5甲基化结果判定标准若仅甲基化引物扩增出阳性条带，为完全甲基化；若仅非甲基化引物扩增出阳性条带，为非甲基化；若两者均扩增出阳性条带，为部分甲基化。

1．5统计学方法采用SPSS13．0分析数据。RASSF2A甲基化、mRNA表达在卵巢肿瘤组织间的差异以及基因甲基化与临床病理特征等计数资料采用χ2检验或Fishier确切概率法。RASSF2A甲基化及其表达之间的关系采用Spearman相关性分析法。卵巢癌细胞系中RASSF2AmRNA表达量比较采用t检验。检验水准α＝0．05。

2结果

2．1卵巢肿瘤组织RASSF2AmRNA的表达表1和图1所示，卵巢良性肿瘤、交界性肿瘤及卵巢癌组织中RASSF2AmRNA表达率依次降低，分别为95．00％（19／20）、59．26％（16／27）和34．00％（17／50），差异有统计学意义，χ2＝21．855，P＜0．001。两两比较结果显示，卵巢癌组与交界性肿瘤组比较，χ2＝4．568，P＝0．033；卵巢癌组与良性肿瘤组比较，χ2＝21．280，P＜0．001；交界性肿瘤组与良性肿瘤组比较，χ2＝7．719，P＝0．005；差异均有统计学意义。

2．2卵巢肿瘤组织RASSF2A基因甲基化水平表1和图2所示，97例卵巢组织标本均成功进行了MSP实验。50例卵巢癌组织标本中有13例发生了部分甲基化，10例完全甲基化，甲基化频率为46．00％（23／50）；27例交界性卵巢肿瘤中甲基化阳性率为22．22％（6／27），其中2例为完全甲基化。而20例良性卵巢肿瘤组织均未扩增出甲基化阳性条带，甲基化频率为0，差异有统计学意义，χ2＝15．474，P＜0．001。

2．3RASSF2A基因甲基化与其表达的相关性表2所示，RASSF2A基因甲基化状态与其mR－NA表达水平呈负相关。在RASSF2A基因发生甲基化的组织中，RASSF2A基因表达明显降低，提示RASSF2A基因高甲基化可能是该基因表达沉默的原因之一。

2．4甲基化状态与卵巢癌临床病理特征相关性表3所示，RASSF2A甲基化程度与卵巢癌患者的年龄、病理类型、临床分期、分化程度及淋巴结转移之间无明显的相关性。

2．55－aza－dC作用结果图3所示，卵巢癌细胞株SKOV3和3AO中均检测到RASSF2A基因甲基化，经去甲基化药物5－aza－dC作用后，SKOV3细胞由完全甲基化转变为非甲基化，而3AO细胞甲基化状态被部分逆转。SKOV3和3AO中RASSF2AmRNA表达水平较低，经药物干预后，SKOV3（t＝－5．258，P＝0．006）和3AO细胞株（t＝－3．060，P＝0．038）RASSF2AmRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义。

3讨论

近年来，随着肿瘤分子生物学及表观遗传学的发展，肿瘤抑制基因失活在癌症发生发展中的作用越来越受到人们的重视。总的来说，其机制可概括为遗传学机制及表观遗传学机制，换言之，肿瘤抑制基因功能的失活既可以是不可逆的，即遗传学机制，如基因的突变或染色体的缺失，也可以是可逆的，即表观遗传学机制，如基因甲基化或组蛋白修饰。与遗传学不同，表观遗传学主要研究内容不涉及DNA序列的改变，且在细胞分裂过程中具有可遗传的、可逆性的基因组修饰作用［5］。DNA甲基化是哺乳动物基因组中最普遍的表观遗传学事件。相对于Knudson’s的二次打击学说，基因甲基化仅靠一次打击就可导致基因失活，肿瘤易感性增加［6］。RASSF2是新近发现的RASSF家族成员之一，生物信息学分析显示，RASSF2与其他成员一样，也含有RAS相关域［7］。RASSF2位于人类常染色体20p13，有329个氨基酸的开放阅读框，11个外显子。根据不同的启动子和外显子选择剪接，可形成RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C3个不同的转录本，其中，RASSF2A是最长的转录本，也是唯一一个含有5′CpG岛的转录本。RASSF2A在卵巢癌组织中发挥抑癌基因的作用，如抑制细胞生长，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡等，是一个肿瘤抑制基因。本研究分析了RASSF2A基因在上皮性卵巢癌组织中的转录表达及其甲基化水平。RT－PC检测结果显示，RASSF2A基因表达水平在良性卵巢肿瘤、交界性肿瘤及卵巢癌组织中依次降低，提示RASSF2A的转录失活，可能参与了卵巢癌的恶性演进过程，RASSF2A在上皮性卵巢癌中也起到抑癌基因的作用。张娴等［8］研究结果显示，RASSF2A基因甲基化可能参与了宫颈癌的发生，与宫颈癌的恶性进展密切相关。本研究结果显示，良性卵巢肿瘤组织中未发生RASSF2A启动子区甲基化，而基因异常甲基化从交界性肿瘤到癌呈逐渐上升的趋势，RASSF2A基因甲基化从无到有，从少到多的现象，说明了RASSF2A基因启动子区甲基化从卵巢上皮增殖阶段就开始起作用，与卵巢癌发生密切相关。多项研究表明，RASSF2A启动子区高甲基化与基因表达沉默有关［9－11］。本研究结果表明，在发生RASSF2A甲基化的组织中，其基因表达水平明显下降，两者呈负相关。结果提示，在卵巢癌中RASSF2A启动子甲基化是导致其低表达或者表达缺失的重要原因，这在细胞试验中也得到验证。应用甲基转移酶抑制剂5－aza－dC对卵巢癌细胞株进行去甲基化处理后，卵巢癌细胞株的基因启动子甲基化被逆转，而其mR－NA的表达水平明显升高，从而进一步证实了RASSF2A启动子CpG岛的异常甲基化在调节RASSF2A基因的表达中发挥重要作用。研究显示，RASSF2A基因甲基化程度与宫颈癌、胃癌的淋巴结转移有关［8，12］，而与胰腺癌和结直肠癌［9，13］患者临床病理特征无关。另有研究表明，基因启动子甲基化水平与癌症患者年龄密切相关［14］。在子宫内膜癌的研究中显示，＞45岁的患者更容易发生RASSF2A甲基化（P＝0．041）［15］。在结肠癌和口腔鳞癌中也发现，RASSF2A基因甲基化程度与年龄相关［13，16］。在生物个体发育过程中，伴随着时间的进程，DNA甲基化异常会不断呈现，由此认为，表观遗传学疾病是一种与年龄相关性疾病。这在某种程度上解释了为什么肿瘤多发生在老年人。检测DNA甲基化程度可作为细胞衰老的标志之一。本研究结果显示，RASSF2A基因甲基化水平与卵巢癌患者的临床病理参数之间无明显的相关性，是上皮性卵巢癌中的早期频发事件，随着患者年龄的增加，RASSF2A基因甲基化有增高的趋势，但差异无统计学意义，可能上皮性卵巢癌中RASSF2A基因甲基化不是年龄相关的表观遗传学改变。

综上所述，RASSF2A启动子区的高甲基化是卵巢癌发生和发展过程中的频发事件，是导致卵巢癌中RASSF2A低表达或表达缺失的重要原因，其参与了卵巢癌的发病过程，并在卵巢癌的发生和发展中发挥着重要作用。监测RASSF2A基因启动子CpG岛甲基化水平可作为表观遗传学的分子靶标，指导卵巢癌的诊断及其预后判定。

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作者：武玉 路炜 刘颖 栾鑫 吴秀芳 单位：聊城市人民医院妇产科 聊城市东昌府人民医院妇产科