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流产组织物的遗传学分析

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摘要:

目的分析胚胎绒毛染色体异常情况与复发性流产之间的临床关系。方法选择2012年2月-2014年2月于河北省人民医院优生优育优教中心和妇产科门诊拟行流产的孕12周内孕妇共149例,分为4组,即正常组30例,病例1组36例,病例2组40例,病例3组43例。应用绒毛染色体细胞培养G显带分析技术、荧光原位杂交技术(FISH)、高通量全基因组DNA测序技术等3种方法对绒毛细胞进行染色体检查。结果149例样本中共有55例染色体异常核型,异常核型中三体综合征占65.45%,以5-三体、16-三体、22-三体多见,Turner综合征占12.73%,结构异常占10.91%;正常组染色体异常率明显低于其他3组,差异有统计学意义(χ2值分别为14.46、22.32和8.25,P<0.01)。病例1组和病例2组染色体异常率差异无统计学意义(χ2=1.29,P>0.05)。病例1组和病例2组染色体异常率明显高于病例3组,差异有统计学意义(χ2值分别为2.7、6.27,P<0.05);发生2次自然流产的胚胎染色体异常率最高,随着自然流产次数增加,胚胎染色体异常率反而呈下降趋势。结论该研究通过绒毛染色体细胞培养G显带分析技术、FISH、高通量全基因组DNA测序技术等对比研究,建立了一套临床医生如何科学地选择绒毛染色体检测方法的标准,有效指导临床。

关键词:

复发性流产;染色体分析;荧光原位杂交技术;高通量全基因组DNA测序技术

自然流产是患病率呈逐年上升趋势的妇产科常见疾病,占临床确诊妊娠的15%~20%。自然流产的病因复杂多样,以胚胎染色体异常为主要病因。因此,本研究选用绒毛染色体细胞培养G显带分析技术、荧光原位杂交技术(FISH)、高通量全基因组DNA测序技术等3种方法对绒毛细胞进行染色体检查,不仅可以对自然流产的病因做出遗传学的判断,还可以为临床妇产科工作者提供如何选用合适的绒毛染色体检测方法提供可靠的指导。

1资料与方法

1.1研究对象选择2012年2月-2014年2月于河北省人民医院优生优育优教中心和妇产科门诊拟行流产的孕12周内孕妇共149例,年龄20~35岁,平均(29.3±0.4)岁。研究对象分为4组:正常妊娠且无流产史拟行人工流产术的孕妇30例(正常组);第1次发生胚胎停止发育的孕妇36例(病例1组);2次胚胎停止发育或自然流产史的孕妇40例(病例2组);3次或3次以上胚胎停止发育或自然流产史的孕妇43例(病例3组)。

1.2绒毛染色体的检测方法常规绒毛组织制片、G显带、显微镜下染色体核型分析。1.3绒毛组织的荧光原位杂交具体步骤按试剂盒 说明进行标本预固定、变性杂交。由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供FISH试剂盒,包括GLP13/GLP21(定位于13q14/21q22)、GLP16/GLP22(定位于16q22/22q11.2)、CSP18/CSPX/CSPY。荧光信号判断:Olympus荧光显微镜下观察,对于正常的绒毛细胞、GLP13(绿色)/GLP21(红色)及GLP16(红色)/GLP22(绿色)探针组杂交后可检测到2个绿色和2个红色信号;CSP18(天蓝色)/CSPX(绿色)/CSPY(红色)探针组可检测到2个天蓝色、1个绿色和1个红色信号(男性),或2个天蓝色、2个绿色信号(女性)。

1.4流产组织染色体异常的高通量全基因组DNA测序技术检测样品准备及DNA提取:取流产的胎儿绒毛组织100mg,用PBS清洗,通过QiagenQIAampDNAMini试剂盒提取全基因组DNA,并对提取的样品进行质控检测;文库构建打断:采用Covaris打断法,将样品DNA打碎至250bp大小的片段;末端修复:使用T4DNAPolymerase、KlenowDNAPolymer-ase和T4PolynucleotideKinase将打断形成的黏性末端修复成平末端;末端加“A”:通过3'端加碱基“A”,使得DNA片段能与3'端带有“T”碱基的特殊接头连接,过程中用磁珠法选择需回收的目的片段产物;聚合酶链式反应(PCR):使用PCR技术(10个循坏)扩增两端带有接头的DNA片段;上述步骤反应后的DNA使用PCRPurificationSystem60mlkit回收,用等体积的AmpureBeads进行纯化;Pooling构建好的文库经Agilent2100Bioanalyzer及实时定量基因扩增荧光检测系统(QPCR)检测合格后,将一定量的文库按照等物质的量混合;上机测序(Hiseq2000)后进行信息分析。

2结果

2.1绒毛染色体细胞培养G显带分析技术检测结果本研究共纳入149例研究对象,其中正常组30例,病例1组36例,病例2组40例,病例3组43例。正常组30例均为新鲜有活力绒毛,故全部采纳绒毛染色体细胞培养G显带分析技术检测,培养成功率100%。其中仅1例为21-三体(3.33%);其余全部为正常核型(96.67%);其余3组均为胚胎停止发育患者,大部分绒毛组织不新鲜,采用绒毛染色体细胞培养G显带分析技术+FISH检测方法,或直接采用流产组织染色体异常的高通量全基因组DNA测序技术检测,以确保检测成功率达100%。共48例进行绒毛染色体细胞培养G显带分析技术检测,培养成功43例(89.58%),失败5例(10.42%)。失败标本中,1例因细胞不贴壁生长,4例未见分裂象;贴壁细胞生长,单细胞状态差,绒毛组织已老化。成功进行染色体核型分析的患者中,核型正常18例(41.86%),核型异常25例(58.14%);未成功的5例均加做FISH检测。

2.2绒毛组织细胞的FISH检测结果选取了9例进行绒毛染色体细胞培养G显带分析技术+FISH检测。9例绒毛中均显示了FISH检测信号,检测成功率为100%。6例绒毛组织中,应用3组FISH探针检测信号与正常组相同,未检测出异常信号。还有3例绒毛组织中检测到了FISH异常信号,包括1例三倍体;1例显示21号染色体均有3个杂交信号,2个X信号;1例18号染色体3个杂交信号,1个X信号,1个Y信号。

2.3流产组织染色体异常的高通量全基因组DNA测序技术检测结果选取了65例病例组绒毛组织进行绒毛组织高通量全基因组DNA测序技术检测,检测成功率达100%。其中26例异常:16-三体6例;5-三体5例;22-三体5例;21-三体1例;13-三体3例;4-三体2例;6-三体1例;45,X03例。

2.4综合绒毛染色体细胞培养G显带分析技术、FISH、高通量全基因组DNA测序技术检测结果综合3种方法发现149例样本中共有55例染色体异常核型,异常核型中三体综合征占65.45%,以5-三体、16-三体、22-三体多见,Turner综合征占12.73%,结构异常占10.91%。4组染色体情况显示,正常组30例中仅1例为13-三体,染色体异常率为3.33%;病例1组染色体异常率44.44%;病例2组染色体异常率57.50%;病例3组染色体异常率34.88%。正常组染色体异常率明显低于其他3组,差异有统计学意义(χ2=14.46、22.32、8.25,P<0.01);病例1组和病例2组染色体异常率差异无统计学意义(χ2=1.29,P>0.05);病例1组和病例2组染色体异常率明显高于病例3组,差异有统计学意义(χ2=2.7、6.27,P<0.05)。

3讨论

妊娠早期的自然流产现已上升为临床妇产科工作中遇到的最常见的疾病之一,患病率逐年上升且病因复杂。胚胎染色体异常为诱发自然流产的一个主要原因[1],同时为出生缺陷的主要危险因素。绒毛细胞和胚胎组织的遗传信息相同,它由受精卵有丝分裂产生,故可以作为检查胚胎染色体的标本[2]。绒毛细胞染色体检查能够帮助临床医生了解胚胎染色体的情况,查找出自然流产的病因,为诊疗工作提供依据。目前检查绒毛染色体的方法常用以下5种:绒毛染色体细胞培养G显带分析技术、FISH、荧光定量PCR(QF-PCR)、高通量全基因组DNA测序技术、微阵列比较基因组杂交技术(Array-CGH)。1983年Simoni等[3]采用直接法首次成功制备了人工流产绒毛染色体,1986年Hansmann等[4]将其用于自然流产的检查取得了良好的效果,之后逐渐广泛应用至今,成为传统的细胞遗传学方法,可以准确检出自然流产物或胎儿染色体结构和数目的异常,是检测自然流产组织染色体核型异常或产前诊断的金标准。该方法技术稳定、质量可靠,能提供染色体改变的完整图,其费用低,临床应用广泛。同样,该技术需要进行细胞培养,耗时长,微小的染色体畸变(<5Mb)不易检出,成功率直接受制于绒毛组织的新鲜程度和绒毛的形态[5]。胚胎停止发育时,绒毛生长受到影响,停止发育时间越长,组织越不新鲜,形态就越差,细胞培养成功率就越低。本研究中正常组绒毛组织全部为新鲜绒毛组织,30例标本绒毛染色体培养全部成功,而其他3组的绒毛标本,选择外观相对新鲜,形态较好的绒毛标本进行细胞培养G显带分析48例,培养成功43例,成功率达89.58%。

FISH利用荧光标记的DNA探针与被检测样本中DNA碱基对的互补性,在探针与样本DNA杂交后,通过荧光显微镜检测荧光信号发现细胞、组织样本中的染色体或基因异常。可以检测细胞间期的染色体,不需要细胞培养,在48h内得到结果,明显减轻患者等待结果过程的焦虑情绪。结果判读简单,精确度高,灵敏性好,特异性强,可检测平衡易位,准确检测3Mb大小的结构异常,用于羊水间期细胞产前诊断非整倍体的检测与核型分析的准确率几乎一致[6]。本研究选取了13/21、16/22、18/X/Y3组探针对9例相对不太新鲜,形态稍差绒毛组织进行细胞培养G显带分析技术和FISH检测。其中5例细胞培养G显带分析技术检测失败,其余4例与FISH检测结果一致,9例FISH检测全部成功。3例绒毛组织中检测到了FISH异常信号,分别为三倍体、21-三体、18-三体。高通量全基因组DNA测序技术以能1次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定等为标志。不需要培养,操作简单,分析周期短,特异性强,分辨率高,覆盖整个基因组,最小可以检测到10Kb的微小片段异常。目前应用较多的是目标基因组区域测序,绒毛样本染色体检测方面,仅用于染色体非整倍体的快速检测。目前进行全基因组染色体检测报道较少。它费用较高,并且不能发现染色体平衡易位、倒位或点突变及染色体整倍体。因此,还不适合作为常规检测方法,但可作为常规染色体核型分析的补充检测手段[7-8]。本研究选取了65例胚胎停止发育时间长,绒毛组织陈旧、形态极差样本进行高通量全基因组DNA测序技术检测染色体,检测成功率达100%,发现26例异常。综合以上,不难发现,临床医务工作者对于流产患者,首选绒毛染色体细胞培养G显带分析技术;其他技术如FISH、高通量全基因组DNA测序技术等可以作为绒毛染色体细胞培养G显带分析技术的补充和完善。所以,应根据胚胎停止发育时间、绒毛组织新鲜程度、患者流产次数和经济状况、对胚胎停止发育流产原因追查的迫切情况等帮助患者分析,选择合适的染色体检测方法。

本研究采用3种绒毛染色体检测技术发现149例样本中共有55例染色体异常核型,异常核型中三体综合征占65.45%,以5-三体、16-三体、22-三体多见,Turner综合征占12.73%,结构异常占10.91%。与文献报道的通过多种方法检测自然流产绒毛组织染色体发现50%~70%存在核型异常,而结构异常比较少见,仅占6%基本一致[9],明显低于86%的异常率[10]。现已证实染色体数目异常发生的主要原因是在发生减数分裂的配子中或早期卵裂的受精卵中出现了染色体异常的分离和复制[11]。从4组染色体情况来看,正常发育胚胎染色体异常率很低;发生1次自然流产和2次自然流产的染色体异常率没有明显差别,约44.44%~57.50%;而3次或3次以上复发性流产的染色体异常率反而较1次或2次流产的低,提示随着流产次数的增加,存在着更多其他方面导致流产的原因。

作者:李亚丽 余小平 王方娜 高健 楚伟 李娟 霍平 王超 单位:河北省人民医院

中华医学遗传学杂志责任编辑:杨雪    阅读:人次