鼠疫病原学分析及流行病学意义范文

摘要:

目的探讨兴海县鼠疫生物学特性及流行病学意义，为鼠疫防治提供科学依据。方法对1956－2009年兴海县自动物及人间分离的鼠疫菌进行糖(醇)类酵解、毒力测定、质粒检查、基因型等实验，对该疫源地分离的鼠疫菌株进行分析。结果对15株鼠疫菌的糖(醇)类酵解试验观察，除自五趾跳鼠分离的菌株鼠李糖为阳性外，其余14株均为青藏高原型;被试菌株均能产生鼠疫菌荚膜抗原(F1)及鼠疫杆菌素I(PstI);毒力抗原因子(VW)阳性的菌株占80.00%(12/15);色素沉着因子(Pgm)阳性的菌株占93.33%(14/15);质粒检查除五趾跳鼠分离的菌株为6×106、29.19×106、65×106，1962年人尸分离的鼠疫菌带有6×106、27.04×106、65×106质粒外，其余菌株均为6×106，45×106，52×106;基因型除五趾跳鼠和1962年人尸上分离的菌株为21型外，其余均为8型;毒力检测结果显示所测菌株80.00%为强毒株。结论兴海县喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地仍处于动物鼠疫流行的活跃期，应加强鼠疫监测和预警，控制人间鼠疫的发生。

关键词:

鼠疫;病原学;流行病学

鼠疫是一种发病急、传播快、病死率高、传染性强的自然疫源性烈性传染病［1］。自20世纪80年代以来，鼠疫在世界范围内又逐渐活跃起来，进入90年代这种趋势更加明显。动物界鼠疫流行范围不断扩大，染疫动物种类不断增多，新的鼠疫自然疫源地不断被发现，疫情呈上升趋势。兴海县于1956年被证实为喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地［2］，动物鼠疫在20世纪60年代流行较为猛烈，并有两次波及人类，特别是1960年发生人间肺鼠疫的暴发流行，时隔47年后，2009年在该县又发生了人间肺鼠疫暴发流行。本文对兴海县1956－2009年自喜马拉雅旱獭、寄生蚤、犬、人尸等分离的15株鼠疫菌进行糖醇类酵解、质粒检查、毒力测定等一系列实验，从而了解该县鼠疫流行病学特征及鼠疫生物学特性，对控制人间和动物鼠疫的发生具有重要的现实意义。现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1实验菌株实验用鼠疫菌15株系1956－2009年自兴海县不同宿主动物体内分离。其中，喜马拉雅旱獭5株、五趾跳鼠1株、古北拟额虱1株、斧形盖蚤1株、犬2株、人尸2株、患者3株。菌株均由青海省国家鼠疫菌保藏中心提供。

1.2实验动物昆明系小白鼠，清洁级，体重18～20g，由青海省实验动物中心提供。

1.3培养基实验用培养基均由青海省地方病预防控制所培养基室按常规制备，经无菌试验后使用。

1.4生化及糖醇类酵解试验参照文献［3］中方法进行。被试菌接种于28℃24h普通琼脂培养上，并用1%蛋白胨水制备成2×1010/ml的菌悬液分别接种于阿胶糖、鼠李糖、麦芽糖、蜜二糖、甘油、脱氮培养基中，混匀后置于37℃温箱中培养，连续观察7d再置于室温下观察7d，逐日观察发酵情况。设鼠疫菌141株，假结核菌PTB5为对照。

1.5毒力因子检查及结果判定参照文献［4］中方法进行。

1.6毒力测定将每株菌的37℃24h培养物用灭菌生理盐水制成菌悬液，比浊后稀释为2×101/ml、2×102/ml、2×103/ml、2×104/ml、2×105/ml、2×106/ml、2×107/ml、2×108/ml、2×109/ml，分别取0.5ml皮下注射于小白鼠鼠鼷部，每组5只动物，分笼饲养观察14d，动物死亡后取淋巴、肝、脾、肺、心组织进行细菌培养，以分离出鼠疫菌为特异性死亡，计算最小致死量(MLD)，并参照文献［5］对鼠疫菌株毒力等级进行分类，即MLD≤10000为强毒菌，10000＜MLD＜100000为中等毒力菌，≥100000为弱毒菌。

1.7质粒分析参照文献［6］的方法进行，质粒DNA相对分子质量(Mr)的测定采用标准质粒对照法。

1.8基因分型在周冬生等［7－8］鉴定的23个DFR中，有3个位于pMT1质粒中，20个位于染色体上。采用ArrayDesigner2.0软件针对每个DFR各设计一对引物，为了证实pMT1的存在，还对pMT1质粒设计了一对引物。PCR反应体系:10×buffer2.5μl，10mMdNTP0.25μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl，10μM引物对0.5μl，5ng/μl模板DNA2μl，用去离子水补足至25μl。PCR扩增条件:95℃预变性3min，按94℃30s、60℃30s、72℃60s扩增30个循环，72℃延伸5min。PCR产物检测:PCR产物在1%～2%的琼脂糖凝胶上电泳，紫外分析仪下观察结果，在预计分子量大小处存在条带者为阳性。每次PCR检测均设阴性对照(用去离子水取代模板)和阳性对照(模板为鼠疫菌菌株91001和82009DNA的混合物，包括全部22个DFR)。可疑PCR结果和阴性PCR结果至少重复一次。

2结果

2.1生化特性依据鼠疫菌分解阿胶糖、鼠李糖、麦芽糖、蜜二糖、甘油及脱氮作用，对15株鼠疫菌进行糖醇类酵解试验观察，除1株自五趾跳鼠分离的鼠疫菌鼠李糖为阳性外，其余14株均为青藏高原型。

2.2毒力因子检查被试菌株均能产生鼠疫菌荚膜抗原(F1)及鼠疫杆菌素I(PstI);毒力抗原因子(VW)阳性的菌株占80.00%(12/15)，阴性的菌株占20.00%(3/15);色素沉着因子(Pgm)阳性的菌株占93.33%(14/15)，阴性的菌株占6.67%(1/15)(见表2)。

2.3毒力测定对分离的15株代表菌株进行毒力测定，其中MLD为10个菌的1株，50个菌的2株，100个菌的7株，1000个菌的3株。按鼠疫菌株毒力等级分类，上述13株为强毒菌株。MLD为1000000个菌的有1株，大于10亿菌的有1株，为弱毒株。

2.4鼠疫菌的质粒种类及组成经琼脂凝胶电泳证实，15株鼠疫菌共观察到3种质粒谱，除五趾跳鼠分离的鼠疫菌带有6×106、29.19×106、65×106，1962年人尸分离的鼠疫菌带有6×106、27.04×106、65×106质粒外，其余13株均带有6×106、45×106、52×106质粒。

2.5基因分型15株鼠疫菌株基因型(DFR)除五趾跳鼠及1962年人尸上分离的菌株其基因型为21型外，其余13株均为8型。

3讨论

选取对鼠疫菌有典型鉴定特征的阿胶糖、鼠李糖、麦芽糖、蜜二糖、甘油对15株鼠疫菌进行糖(醇)酵解试验观察［9］，除1株自五趾跳鼠分离的鼠疫菌为阳性外，其余14株生化特性典型，均为青藏高原型。毒力因子检查结果被试菌株均能产生鼠疫菌荚膜抗原(F1)及鼠疫杆菌素I(PstI);毒力抗原因子(VW)阳性的菌株占80.00%(12/15)，阴性的菌株占20.00%(3/15);色素沉着因子(Pgm)阳性的菌株占93.33%(14/15)，阴性的菌株占6.67%(1/15)。对该地区分离的15株代表菌株进行毒力测定，结果显示80.00%为强毒株。15株菌的质粒组成除五趾跳鼠分离的鼠疫菌带有6×106、29.19×106、65×106，1962年人尸分离的鼠疫菌带有6×106、27.04×106、65×106质粒外，其余13株均带有6×106、45×106、52×106质粒。15株鼠疫菌株基因型(DFR)除五趾跳鼠及1962年人尸上分离的菌株其基因型为21型外，其余13株均为8型。以上结果显示1956－2009年兴海县分离的15株鼠疫菌株具备典型的青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的病原学特性，其生物型为古典型，生态型为青藏高原型。毒力强，给人类带来极其严重的危害。

兴海县为青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，具有面积广、疫点多、动物鼠疫流行较为猛烈等特征，是动物和人间鼠疫流行的高发地区。2009年7月，兴海县发生一起肺鼠疫暴发流行，发病12人，死亡3人。追溯历史，兴海县时隔47年后再次发生人间鼠疫，说明疫源地由静息期转入活跃期。究其原因，除了自然因素外，不能排除动物鼠疫流行间断期间，未开展连续性动物鼠疫监测。兴海县动物鼠疫流行的态势与青海省动物鼠疫流行态势相比较，可以认为兴海县旱獭鼠疫疫源地仍处于动物鼠疫流行的活跃期。基于兴海县鼠疫流行病学特征，应在鼠疫自然疫源地及地区实施鼠疫防治知识全员培训，加大宣传教育力度，对医务人员进行鼠疫预防控制知识的培训，实施首诊医生责任制［10］;科学规范地开展鼠疫监测，掌握动物鼠疫流行的态势，控制动物鼠疫，一旦发生人间鼠疫，必须按规定在短时间内采取紧急处理措施，彻底消灭传染源，切断传播途径防止人间鼠疫扩散蔓延［11］，是当前及今后相当长一段时期兴海县鼠疫防治的工作重点。

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作者：冯建萍 祁美英 魏柏青 熊浩明 金星 金泳 杨晓艳 靳娟 辛有全 唐新元 王梅 戴瑞霞 单位：青海省地方病预防控制所