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高压氧治疗大鼠肝脏组织病理

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【摘要】

目的探讨高压氧治疗对脊髓损伤大鼠肝脏组织病理形态的影响。方法把40只SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、脊髓损伤对照组、高压氧对照组和脊髓损伤高压氧治疗组,每组10只。使用改良的Allen’s打击法将脊髓损伤对照组和脊髓损伤高压氧治疗组大鼠制成T8~9急性损伤模型。空白对照组和脊髓损伤对照组进行正常饲养不予高压氧处理。高压氧对照组及脊髓损伤高压氧治疗组行高压氧处理,治疗方案为每24h行高压氧处理1次,连续治疗14d。治疗结束后取各组大鼠肝脏作病理切片并观察其在光学显微镜下组织结构改变情况。结果空白对照组与高压氧对照组大鼠肝脏组织切片在光镜下未发现病理改变,脊髓损伤对照组与脊髓损伤高压氧治疗组大鼠肝组织均出现肝损伤病理学改变,脊髓损伤高压氧治疗组的损伤程度明显轻于脊髓损伤对照组。结论高压氧治疗对大鼠脊髓损伤后肝细胞损伤具有保护作用。

【关键词】

脊髓损伤;高压氧;肝细胞;显微结构;大鼠

脊髓损伤是临床常见的神经系统严重损伤性疾病[1],缺血再灌注损伤在脊髓损伤非常常见,可发生在于全身各个器官和组织,其中发生在肝脏的缺血再灌注损伤被称为肝脏缺血再灌注损伤[2]。高压氧是治疗脊髓损伤的有效方法之一,能改善脊髓损伤后损伤局部及相关脏器发生缺血再灌注损伤、炎症反应等,在减轻继发性损伤方面具有重要作用[3]。脊髓损伤后继发性肝损害的严重程度与缺血再灌注损伤程度密切相关,缺血再灌注损伤可引起肝细胞功能和结构损害,及时纠正脊髓损伤后肝缺血再灌注损伤可有效防止继发损害。本实验通过观察高压氧对脊髓损伤大鼠的缺血再灌注损伤肝脏病理形态的影响,探讨可能机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组健康SD大鼠40只(雌雄各半),体质量(180±10)g,购自广东省动物中心,动物使用许可证号:SCXk(粤)2008-0002。大鼠按随机数字表法分为空白对照组、脊髓损伤对照组、高压氧对照组和脊髓损伤高压氧治疗组,每组10只。

1.2主要仪器和试剂自制Allen’s打击器,动物实验纯氧舱购自宁波高压氧舱总厂,正置荧光显微镜(OlympusBX-51,日本)。

1.3模型制备及治疗方法由同一人操作,采用改良Allen’s法制作大鼠T8~9急性脊髓损伤模型。10%水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠,俯卧固定后取大鼠背中段正中切口行T8~9棘突椎板切除,暴露脊髓硬膜。打击器使用10g砝码自距硬膜5cm高处垂直落下,打击量约50g•cm,撞击置于T8~9脊髓上的灭菌垫片,完成模型制作。打击后以大鼠身体抖动、摆尾及后肢抽动为造模成功特征。脊髓损伤对照组、脊髓损伤高压氧治疗组大鼠制备急性脊髓损伤模型,本实验20只大鼠急性脊髓损伤造模均成功。各组大鼠进行处理如下:①空白对照组:健康大鼠正常饲养,不做任何处理。②脊髓损伤对照组:造模后大鼠正常饲养,不做其余处理。③高压氧对照组:健康大鼠正常饲养,进行1个疗程高压氧处理。④脊髓损伤高压氧治疗组:造模后大鼠正常饲养,并进行1个疗程高压氧处理。脊髓损伤高压氧治疗组大鼠于造模成功后4h置于动物实验纯氧舱(采用缝隙加湿洗舱)内进行治疗。20min匀速加压至0.2MPa(2ATA),舱内氧浓度维持在80%~85%,治疗持续80min,20min匀速减压出舱;高压氧处理频率为1次/24h,连续14次,共14d。高压氧对照组采用健康大鼠进行高压氧处理,治疗方案同上。

1.4肝脏组织病理观察1个疗程(14次)高压氧处理结束后,24h内处死各组大鼠,取肝脏右叶约5mm×10mm×3mm组织置于10%中性甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,片厚6μm连续切片,苏木精-伊红染色,光镜下观察肝组织形态学改变。

2结果

空白对照组大鼠肝细胞及肝窦内皮细胞无明显变形、坏死,中央静脉、汇管区结构清晰(图1A)。高压氧对照组大鼠肝细胞结构饱满,边界清晰,组织形态基本接近空白对照组(图1B)。脊髓损伤对照组较空白对照组肝细胞明显肿胀,细胞核轮廓改变,肝血窦明显淤血,炎性细胞浸润,可见肝脏结构破坏(图1C)。脊髓损伤高压氧治疗组大鼠肝脏淤血较脊髓损伤对照组减轻,肝小叶结构基本正常,肝血窦淤血明显减轻,肝窦索结构清晰,肝细胞轻度肿胀(图1D)。

3讨论

3.1急性脊髓损伤后肝损伤的严重影响脊髓损伤可触发全身炎症发应,后者是伤后继发性脏器损伤并发症高发生率的重要原因,尤其是当损伤发生在颈段或高位胸椎时[4]。肝损害的严重程度及其恢复情况,与缺血再灌注损伤程度有密切关系,缺血再灌注损伤可引起肝细胞功能和结构损害,造成细胞内线粒体呼吸链不可逆性损害,引起大量肝组织坏死、功能衰竭,甚至最终引起机体死亡。及时纠正脊髓损伤后肝缺血再灌注损伤是防止继发损害、顺利康复的关键[5]。肝脏在全身炎症反应的起始及播散过程中,发挥至关重要的作用,了解脊髓损伤后并发急性肝缺血再灌注损伤的病理改变及分子机制,对减轻脊髓损伤的临床并发症、改善预后具有非常重要的意义。

3.2脊髓损伤及脏器缺血再灌注损伤作用机理脊髓损伤发生后,由于神经轴突连接中断、无法再生以及运动、感觉功能丧失,引起一系列神经、精神严重损伤,可对机体造成毁灭性影响[6]。脊髓损伤后各组织器官的病理生理进程包括局部血管紊乱,免疫炎性反应,自由基释放和脂质过氧化,兴奋性谷氨酸中毒和离子失衡,细胞凋亡和轴突脱髓鞘等,各种机制之间相互影响、相互促进,加重损伤程度,大量细胞走向不可逆性死亡[7]。其中局部血管改变和缺血缺氧是脊髓继发性损伤最重要的机制。伤后机体处于强烈应激状态,全身血液流向重新分布。脊髓损伤后因血管性因素引起的局部变化主要包括:出血、缺血再灌注损伤和微循环障碍[8]。缺血再灌注损伤是指缺血、缺氧的组织或器官在重新获得血液及氧气供应后,组织、器官的损害不但没有减轻,反而更加严重的病理生理过程[9],这是一种功能代谢障碍及结构破坏的加重现象。肝缺血再灌注损伤主要经历以下两个过程[2]:早期时相在再灌注后6h内发生,主要为库普弗细胞释放多种炎症因子[10],激活肝窦内皮细胞及肝实质细胞使其产生活性氧及表达黏附分子[11];晚期时相则是细胞因子和趋化因子引起白细胞在肝组织浸润,引起肝损伤。库普弗细胞在肝脏缺血再灌注损伤的启动中起重要作用,膜识别受体,尤其是脂多糖通过Toll样受体4激活库普弗细胞,激活的库普弗细胞通过NF-κB通路产生多种炎症因子,引起肝组织损伤[12]。另外,缺氧造成细胞内线粒体功能严重损伤,组织细胞凋亡,脏器功能失调,脊髓损伤后局部炎症反应产生的炎症因子及抗炎介质进入血液循环,可触发全身炎症反应[13],播散性炎性细胞活化与炎症介质泛滥形成瀑布效应,进而影响全身各组织脏器细胞损伤、凋亡,引发脏器功能障碍。而肝脏在脊髓损伤后全身炎症反应中担任重要角色。因此,对脊髓损伤后受损肝脏,需尽早改善缺氧、水肿,纠正肝脏能量代谢障碍。

3.3高压氧对急性脊髓损伤后肝脏缺血再灌注损伤的影响肝脏功能损害的严重程度及恢复进程,与全身缺血再灌注损伤程度密切相关。高压氧可有效改善机体组织器官的有氧代谢,其作为一种可减轻组织、细胞缺血再灌注损伤,保护细胞功能的疗法,近年逐渐引起基础与临床广泛关注[14]。谢小丰等[15]发现高压氧可使家兔肝缺血再灌注损伤后的能量代谢指标较快恢复,证实高压氧对缺血再灌注损伤肝脏组织有保护作用。本课题组前期研究发现[16-17]:大鼠脊髓损伤后予1个疗程高压氧处理,对继发性心肌细胞损伤、脾细胞损伤均有保护作用。在高压氧条件下动脉血氧张力增大,组织含氧量、氧储量增加,氧弥散提高;且此时红细胞弹性改善,血小板黏度降低,有利于肝内循环好转,肝内微循环改善,增加对远处细胞的血供,进一步满足肝脏对能量和营养的需求,提高再生因子与肝细胞受体结合,有利于肝细胞再生与再生肝组织结构重建[18-20]。本实验结果发现:空白对照组大鼠肝细胞及肝窦内皮细胞无明显变形、坏死,中央静脉、汇管区结构清晰(图1A)。高压氧对照组大鼠肝细胞结构饱满,边界清晰,组织形态基本接近空白对照组(图1B)。脊髓损伤对照组较空白对照组肝细胞明显肿胀,细胞核轮廓改变,肝血窦明显淤血,炎性细胞浸润,可见肝脏结构破坏(图1C)。脊髓损伤高压氧治疗组大鼠肝脏淤血较脊髓损伤对照组减轻,肝小叶结构基本正常,肝血窦淤血明显减轻,肝窦索结构清晰,肝细胞轻度肿胀(图1D)。本实验从肝脏细胞形态学上证明,脊髓损伤后予高压氧处理对肝脏细胞具保护作用。一旦出现脊髓损伤,可考虑予高压氧处理。

3.4实验研究及临床治疗展望本实验从显微结构形态学上直观地证实脊髓损伤后肝组织继发性受损情况,以及高压氧处理对脊髓损伤大鼠肝脏组织病理变化的影响。实验结果可见,高压氧处理可能在减轻脊髓损伤后肝脏细胞继发性损伤方面具有保护作用。肝缺血再灌注损伤在脊髓继发性脏器损伤中起至关重要的作用,对临床病人整体预后有重要影响,高压氧治疗具有一定实用性。本课题组在研究脊髓损伤大鼠进行高压氧处理后,损伤局部神经功能恢复情况的同时,观察到高压氧治疗对继发性肝缺血再灌注损伤程度有良好的缓解作用。但因实验条件等因素限制,目前仅在肝细胞病理结构上作初步检测及分析。在后续研究中,我们将进一步检测实验大鼠脊髓损伤后受损肝脏局部炎性指标进行量化分析,结合统计学数据,进而探讨高压氧改善脊髓损伤后继发性肝细胞损伤的可能机制,为临床治疗提供理论依据。

作者:曾雁雁 黄怀 陈辉强 姚孟宇 叶水林 张旭 陈晓东 张伟 单位:广州军区广州总医院神经医学专科医院神经康复二科

中华肝脏病杂志责任编辑:杨雪    阅读:人次