滑膜炎颗粒对关节炎的治疗作用范文

《中国中医基础医学杂志》2014年第六期

1材料与方法

1.1实验方法

1.1.1实验分组动物购进后适应性喂养2d制备CIA模型，成模后根据造模及给药情况进行随机分组，分为8组，每组11～12只大鼠，分别为对照组(Ⅰ)、不完全弗氏佐剂组(Ⅱ)、模型组(Ⅲ)、雷公藤多苷组(Ⅳ)、醋酸泼尼松龙组(Ⅴ)、滑膜炎颗粒大剂量组(Ⅵ)、中剂量组(Ⅶ)、小剂量组(Ⅷ)。

1.1.2主要试剂配制Ⅱ型胶原配置:取适量牛Ⅱ型胶原溶液逐滴加入等容积的不完全弗氏佐剂中，匀浆器分散使其充分乳化，以滴入水中不扩散为标准，配成浓度为1mg/mL的乳剂，以上操作均在冰浴中进行。

1.1．3CIA模型的制备参照文献［2］，取Ⅱ型胶原乳剂注射于大鼠尾根部皮下，0.2ml/只。7d后加强免疫1次，0.1ml/只注射于大鼠尾根部皮下;对照组注射生理盐水，佐剂组注射不完全弗氏佐剂。造模成功后，按足趾肿胀度调整各造模组动物，剔除未成模大鼠。

1.1.4给药方法加强免疫6d后开始给药，对照组、不完全弗氏佐剂组及模型组给予等体积纯水。雷公藤多苷片9.45mg/kg，醋酸泼尼松龙2.70mg/kg，滑膜炎颗粒分为大、中、小3个给药剂量，分别为9.68g生药/kg、4.84g生药/kg、2.42g生药/kg。给药体积1mL/100g，每天1次，连续灌胃给药36d，每周监测体质量1次。

1.1.5足趾容积测定致炎前在大鼠后肢踝关节上方0.5cm处划一水平标志线，用足趾容积测量仪测量其容积，左手握住大鼠前肢，右手捉住大鼠后膝关节处使其后脚伸直，以仪器托手架做依托，缓慢放入测量杯内，当水平面与鼠足部测量标线重叠时按下测量开关。加强免疫后每3d测1次足趾容积，计算关节肿胀度。肿胀度=(造模后左后足容积+造模后右后足容积)－(造模前左后足容积+造模前右后足容积)。

1.1.6关节炎指数评分给药开始进行关节炎指数评分，每3d1次。关节炎指数评分标准:前爪:关节的炎症(无0分，有1分);后爪:肿胀(无0分，轻度1分，中度2分，重度3分);指掌关节变形(无0分，有1分)，前爪和后爪指(趾)红肿(无0分，有1分);跖骨变形(无0分，有1分)［3，4］。

1.1.7踝关节病理形态改变末次给药后24h处死动物，取踝关节固定于10%的福尔马林溶液中，脱钙后常规石蜡包埋、切片、HE染色观察踝关节形态学改变。根据关节各部位病变轻重程度建立定量评分标准［5］:依次定量为1分(轻度或少量)、2分(中度或多量)、3分(重度或大量)，无病变组织为0分。累加各单项评分即为损伤总分，得分越高即表明损伤程度越严重，并对各单项评分及总分进行组间比较。

1.1.8流式细胞仪检测大鼠T细胞亚群按试剂盒说明操作，末次给药后24h腹主动脉取血处死大鼠，收集EDTA抗凝大鼠全血200μL，分别加入APC标记的CD3抗体、PE标记的CD4抗体和FITC标记的CD8抗体，室温避光孵育30min，加入2.0mL裂解液轻轻振荡，室温孵育15min，200Xg，离心5min弃上清，加入2mL含1%胎牛血清的PBS重悬血细胞悬液，200Xg，离心5min弃上清，重悬细胞悬液于0.5mLPBS中，上机检测。

1.2统计学方法

应用GraphPadPrism4.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x珋±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1滑膜炎颗粒对CIA大鼠体质量的影响图1显示，造模后随着给药时间延长，各组动物体质量均增加，但模型组及各给药组体质量增加较空白对照组缓慢，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。各给药组体质量高于模型组，但与模型组比较差异无统计学意义。

2.2滑膜炎颗粒对CIA大鼠足趾肿胀度影响测量造模前后大鼠足趾容积比较各组大鼠足肿胀情况，结果表明加强免疫后6d，各造模组动物足趾出现不同程度肿胀，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。随着给药时间延长，所有大鼠足肿胀程度均有不同程度减轻，各给药组动物足肿胀程度较模型组减轻更明显。其中Ⅳ组TGT组给药12d时，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05);Ⅴ组醋酸泼尼松龙组于给药6d起，足趾肿胀度减轻明显，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01);Ⅶ组滑膜炎中剂量组给药后15d、18d、24d、27d、30d、33d与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05，图2)。

2.3滑膜炎颗粒对CIA大鼠关节炎指数影响关节炎指数评分结果显示，对照组、佐剂组大鼠关节无改变，各造模组动物关节红肿、变形，随着给药时间延长各组关节红肿情况逐渐减轻，其中Ⅳ组雷公藤多苷片组给药12d、21d关节炎指数评分于模型组，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05);给药36d关节炎指数评分高于模型组，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组关节炎指数评分均低于模型组，其中Ⅴ组醋酸泼尼松龙组于给药6d开始，关节指数评分与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01);，Ⅵ组滑膜炎大剂量组于给药12d、21d、24d关节炎指数评分与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);Ⅶ组于给药12d、21d、24d、30d与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01，图3)。

2.4滑膜炎颗粒对CIA大鼠踝关节病理形态学变化的影响图4显示，正常对照组、不完全佐剂组关节及滑膜结构正常，关节软骨表面光滑平整，无炎细胞及淋巴细胞浸润现象，无血管翳形成。模型组关节腔明显变窄，TPT、泼尼松龙和滑膜炎各剂量组出现滑膜、软骨、纤维组织及小血管增生，炎性细胞浸润，但较模型组有明显改善(图4)。根据关节各部位病变轻重程度建立定量评分标准(如表1)，各给药组病理损伤与模型组比较差异有统计学意义。

2.5滑膜炎颗粒对CIA大鼠T细胞亚群影响表2显示，流式细胞仪检测各组大鼠外周血T细胞亚群的变化，结果显示模型动物和各给药组CD3+T(TT)细胞总数在外周血T细胞所占的百分比与正常对照组比较差异无统计学意义。各组Th细胞在CD3+T细胞中所占百分比显著高于正常对照组，Ⅲ、Ⅴ、Ⅷ组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05);滑膜炎颗粒各给药组Th细胞百分比均较模型组有所下降，但与模型组比较无统计学意义;各组大鼠Tc细胞在CD3+T细胞中所占比例显著低于正常对照组，Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05);各组大鼠Th/Tc的比值明显高于对照组，Ⅲ、Ⅴ组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);滑膜炎颗粒各给药组Th/Tc比值均较模型组有所下降，但差异无统计学意义。

3讨论

类风湿关节炎属于中医学“痹证”范畴，因阳气受损、腠理空虚、卫气不固、风寒湿邪乘虚侵袭肌肤，致气血凝滞、经络痹阻，从而导致患部肿胀疼痛，关节僵硬变形。在RA中滑膜的持续性增生、软骨和骨组织的破坏是其重要的病理学特征。目前RA动物实验研究中，主要采用佐剂性关节炎模型(AA)和CIA模型。模型大鼠关节病理观察显示，CIA大鼠滑膜增生、软骨破坏、炎细胞浸润程度较AA大鼠明显，持续时间也较AA模型长，与RA临床特点更接近［1］。故本实验采用Ⅱ型胶原大鼠尾根部注射，制备CIA模型。造模后大鼠体质量增长缓慢，较对照组体质量明显降低，加强免疫后6d，大鼠出现关节红肿、活动受限，随着病程进展，受累关节出现不同程度变形，提示CIA模型成功。糖皮质激素在RA急性期能迅速减轻关节疼痛和肿胀症状。雷公藤多苷具有抗炎及免疫抑制作用，广泛用于RA的治疗［6］，故本实验选取醋酸泼尼松龙与雷公藤多苷片作为西药和中药阳性对照药物，二者对CIA模型呈现出较好的治疗作用。然而随着给药时间延长，雷公藤多苷片组关节变形改善较差，故给药36d时关节炎指数评分高于模型组。滑膜炎颗粒功效清热利湿、活血通络，用于治疗急、慢性滑膜炎，其中夏枯草、薏苡仁、防己、泽兰、黄芪促进积液吸收;土茯苓、豨莶草、丝瓜络改善关节活动度;川牛膝、丹参、当归消肿止痛;女贞子、功劳叶强壮关节［7］。本实验滑膜炎颗粒各剂量组能够改善足趾肿胀程度和关节炎指数评分，高剂量组(9.68g生药/kg)、中剂量组(4.84g生药/kg)与模型组比较差异有统计学意义，小剂量组也呈现较好的治疗趋势。踝关节病理切片显示，模型组关节腔明显变窄，软骨、纤维组织及小血管增生，炎性细胞浸润，滑膜炎颗粒各给药组能够不同程度改善上述症状，踝关节病理形态变化评分低于模型组，表明滑膜炎颗粒对RA滑膜损伤具有较好的治疗作用，与整体足趾肿胀程度和关节炎指数的检测结果相一致。

T淋巴细胞是机体免疫系统中的主要调节及效应细胞，根据其表面标志不同成熟T细胞可分为2个亚类，即CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞按其功能可分为辅助性T细胞(TH)和迟发型超敏性T细胞(TDTH)，前者为调节性T细胞，后者为效应性T细胞。CD8+T细胞也是不均一的细胞群，按其功能分为抑制性T细胞(TS)和杀伤性T细胞(TC)，前者为调节性T细胞，后者为效应性T细胞。近年来，分泌白介素17的CD4+T细胞亚群(TH17细胞)被认为与类风湿关节炎的发病密切相关，RA患者体内以CD3+CD4+T淋巴细胞亚群异常增加为特征，异常活化的CD3+CD4+T淋巴细胞通过释放大量促炎性细胞因子加速病灶部位的组织损伤［8］。本研究各造模组大鼠Th细胞百分比、Th/Tc均高于空白对照组，Tc细胞百分比均低于对照组，与文献报道相一致。滑膜炎颗粒各给药组Th细胞百分比、Th/Tc均低于模型组，Tc细胞百分比均高于模型组，说明滑膜炎颗粒对CIA大鼠关节损伤治疗作用与降低Th细胞百分比相关。而泼尼松龙组Th细胞百分比、Th/Tc与模型组大体相当，说明其治疗RA作用与Th细胞可能不相关。总之，本实验应用CIA模型动态监测滑膜炎颗粒抗类风湿作用，并通过流式细胞仪深入探讨其作用效应与T细胞亚群的相关性，为临床应用滑膜炎颗粒治疗RA滑膜损伤提供了实验参考，然而其作用机制有待进一步研究。

作者：孙丽华张志伟张华健周艳华崔海峰于友华王正品孙明杰单位：中国中医科学院医学实验中心中药注射剂新药开发技术国家地方联合工程实验室 河北省中药注射液工程技术研究中心神威药业集团有限公司