IBDV对病毒致病性的影响范文

《中国预防兽医学报》2014年第八期

1材料和方法

1.1拯救病毒电镜观察将固定于2.5%戊二醛溶液的rH4AGtB、rH4AH4B及rH4AHuB法氏囊组织进行冰冻切片观察，以观察切片组织中是否存在晶格样排列的病毒粒子。

1.2拯救病毒RT-PCR鉴定从拯救病毒的法氏囊组织中提取RNA，并进行反转录，分别利用引物AU/F6VP2Q1512L(5''''-GGATACGATCGGTCTGACCCCGGGGGAGTC-3''''/5''''-CTTCAGGGGAGAGTTGAGGTC-3'''')、BU/B1344L(5''''-GGATACGATGGGTCTGACCCTCTGGGA-3''''/5''''-TCTAGGTCAATTGAGTACCAC-3'''')进行A和B节段扩增，将扩增产物测序分析。

1.3拯救病毒ELD50的测定以PBS将拯救的病毒10倍递次稀释，选取10-2～10-76个稀释度，分别接种9日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜，每个稀释度接种5个鸡胚，连续培养观察7d，剔除24h内死亡的鸡胚，按Reed-Muench法计算接种其ELD50。

1.4动物试验设计将3周龄SPF鸡随机分为4个组，每组15只。试验组1～3分别接种103ELD50的rH4AGtB、rH4AH4B、rH4AHuB，对照组接种相同体积的DMEM。接毒后7d内，每天观察实验鸡的临床症状，记录各试验组接种鸡的死亡情况，计算其死亡率。接毒后第7d，迫杀各组鸡只，观察法氏囊病变，称取每只鸡的体重及囊重，计算囊指数(BBIX)；取部分法氏囊组织用10%中性福尔马林固定，进行病理组织学分析。提取接毒后第4d收集法氏囊组织的RNA，进行病毒含量的测定。

2结果

2.1拯救病毒法氏囊眼观病变将含有IBDV的A和B节段的重组质粒以不同组合转染DF1细胞72h后，再接种于SPF鸡的法氏囊中，与对照组相比，rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB接种鸡法氏囊出现明显萎缩现象，个别法氏囊呈“紫葡萄”样，法氏囊内有明显的出血斑点，含有大量粘液或炎性渗出物(图略)。

2.2拯救病毒电镜观察利用电子显微镜观察rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB感染鸡法氏囊组织制备的冰冻切片，均可以在视野中观察到IBDV病毒粒子呈“晶格”样排列(图2)。

2.3拯救病毒RT-PCR检测以rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB接种鸡法氏囊中提取RNA反转录产物为模板，扩增获得预期大小为1400bp、1340bp的IBDVA和B节段部分片段(图略)。测序显示：拯救病毒基因组序列与构建克隆序列完全一致。

2.4拯救病毒ELD50的测定测定结果表明，rH4AH4B、rH4AHuBELD50相同，均为107.5/mL，第4d为两者的死亡高峰期，rH4AH4B死亡鸡胚数量为10枚，rH4AHuB为13枚；另外，rH4AHuB10-2～10-4稀释度的鸡胚接种后第4d全部死亡，但rH4AH4B仅10-2稀释度的鸡胚全部死亡。rH4AGtBELD50为105.33/mL，该病毒引起接种鸡胚死亡时间有所推迟，接种后第6d、第7d仍有鸡胚死亡。

2.5拯救病毒体内复制滴度的测定与3个试验组相比，对照组中未检测到任何IBDVRNA拷贝数，与实际相符。rH4AH4B、rH4AHuB试验组RNA的拷贝数高于rH4AGtB，但前者与rH4AGtB无明显差异(p>0.05)，后者与rH4AGtB之间存在明显差异(p<0.05)。

2.6拯救病毒试验鸡囊指数(BBIX)rH4AGtB、rH4AH4B、rH4AHuB3个试验组接种鸡BBIX均低于0.7(图4)，表明其法氏囊均出现严重的萎缩现象，但各试验组之间的BBIX无明显差异(p>0.05)。

2.7拯救病毒对鸡法氏囊组织病理学变化rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB3个试验组接种鸡法氏囊均出现明显的病理变化，淋巴滤泡内淋巴细胞坏死崩解或消失，多数滤泡内淋巴细胞消失不见，间质小血管严重淤血，成纤维细胞增生，其病理组织学打分(HBLS)均在4以上(图5)。对照组法氏囊无明显病理变化，其HBLS为1。

2.8拯救病毒对SPF鸡的致死率rH4AGtB、rH4AH4B、rH4AHuB均能引起接种鸡死亡，但每组死亡鸡的数目及死亡时间不同。rH4AHuB接种鸡第3d为死亡高峰期，5d后不再死亡，其对SPF鸡的致死率高达80%。rH4AH4B接种鸡死亡高峰期有所推迟，第4d为其死亡高峰期，其对SPF鸡的致死率为73.3%。rH4AGtB接种鸡死亡的数量明显低于rH4AH4B和rH4AHuB，对SPF鸡的致死率仅为33.3%。

3讨论

IBDV早期研究认为，B节段或其编码的VP1蛋白与IBDV的毒力无关。Islam等认为，具有多功能酶活性的VP1可以通过影响IBDV的复制，进而影响病毒的毒力及致病性[11]。LeNouen等发现A节段源于强毒，而B节段源于非强毒的病毒比B节段源于强毒的病毒毒力要低。Liu等也证明了VP1蛋白与病毒的毒力有关。本研究将IBDVHLJ0504超强毒株的A节段分别与3个亚群B节段进行组合，拯救了3种重组病毒rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB。接种鸡法氏囊冰冻切片观察，3种重组病毒在接种鸡法氏囊内呈包涵体形式。RT-PCR检测结果表明，拯救病毒基因组序列中不存在任何点突变。体内复制滴度检测结果表明，rH4AH4B、rH4AHuB试验组复制滴度高于rH4AGtB，但前者与rH4AGtB没有明显差异(p>0.05)，后者与rH4AGtB之间存在明显差异(p<0.05)。这与之前研究结果一致，强毒来源的VP1对于病毒在体外的复制能力存在负效应，对体内的复制则存在正效应。HuB-1株及HLJ0504株的B节段在遗传进化分析中分别处于第Ⅲ亚群和第Ⅱ亚群，这两个亚群均为vvIBDV；Gt株的B节段则处于第Ⅰ亚群(non-vvIBDV亚群)，因此在具有相同A节段的情况下，包含第Ⅱ、Ⅲ亚群B节段的rH4AH4B、rH4AHuB体内复制能力更强，而包含第Ⅰ亚群B节段的rH4AGtB体内复制能力较弱。rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB对接种鸡产生明显的致病性。接种鸡法氏囊严重萎缩；病理切片观察，接种鸡法氏囊有明显的病理变化，多数滤泡内淋巴细胞消失，其HBLS均在4以上；而且3种重组病毒均能引起接种鸡的死亡，rH4AHuB引起雏鸡死亡率为80%、rH4AH4B次之为73.3%、而rH4AGtB仅为33.3%。rH4AHuB接种鸡第3d为死亡高峰期，5d后不再死亡，其对SPF鸡的致死率高达80%。rH4AH4B接种鸡死亡高峰期有所推迟，第4d为其死亡高峰期，其对SPF鸡的致死率为73.3%。rH4AGtB接种鸡死亡的数量明显低于rH4AH4B和rH4AHuB，对SPF鸡的致死率仅为33.3%。以上结果表明，IBDVB节段影响病毒的致病性，第Ⅱ、Ⅲ亚群的B节段使IBDV的致病性增强，而第Ⅰ亚群的B节段则使IBDV的致病性减弱。

该研究结果与之前研究一致，LeNouen等对一株自然分离毒株分析报道，该分离毒株的A节段来源于vvIBDV，B节段来源于非强毒株，结果表明与完全vvIBDV相比，该分离毒株对SPF鸡的致病性大大降低。但与Boot等研究有所不同，Boot等拯救了一株其A节段来源于弱毒，而B节段来源于vvIBDV的重组病毒，研究表明该重组病毒不能引起接种鸡的临床症状，更不可能引起接种鸡的死亡。综上所述，IBDVB节段影响病毒的致病性，不同亚群B节段对IBDV致病性的影响作用不同。其中，第Ⅱ、Ⅲ亚群B节段能够提高病毒在体内的复制能力，从而使IBDV的致病性增强，而第Ⅰ亚群的B节段则降低了病毒在体内的复制能力，使IBDV的致病性减弱。然而，不同亚群B节段影响病毒复制及致病性的分子机制还有待于进一步研究。

作者：高立李凯祁小乐高玉龙高宏雷王永强孔宪刚王笑梅单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病科技创新团队