禽多杀性巴氏杆菌免疫效果的检测范文

《中国预防兽医学报》2014年第八期

1材料和方法

1.1动物免疫1日龄非免疫雏鸡共60只，饲养至4周龄时随机平均分为3组，分别为rPtfA组、弱毒活疫苗组和PBS对照组。弱毒活疫苗组肌肉注射1羽份/只，PBS对照组皮下多点注射0.5mL/只，rPtfA组在初次免疫时以纯化的rPtfA蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合进行乳化，皮下多点注射0.5mg/只，2免和3免时以纯化的rPtfA蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合进行乳化，皮下多点注射0.5mg/只。以上3组均免疫3次，每次间隔2周。

1.2免疫抗体检测免疫后每周采血，分离血清，以禽P.multocida菌悬液为包被抗原，以兔抗鸡IgG-HRP为二抗进行间接ELISA试验测定血清抗体水平，测定OD490nm值，从初免后第1周进行检测，共检测6周。

1.3外周血T淋巴细胞增殖试验各免疫组雏鸡分别于初免后第2周、第4周、第6周无菌心脏采血，分离外周血淋巴细胞，进行MTT试验测定外周血T淋巴细胞的增殖水平。试验设检测孔和对照孔，检测孔以ConA蛋白为刺激物，对照孔不加刺激物，反应结束后测定OD570nm值，计算刺激值SI(SI=OD检测孔/OD对照孔)。

1.4IFN-γ分泌水平检测每次免疫2周后，采血分离外周血淋巴细胞，调整浓度为1×107个/mL。按上述同样方法制备ConA蛋白诱导的外周血淋巴细胞，37℃5%CO2培养72h后，吸取培养上清液离心收集后-20℃保存。按照鸡IFN-γ检测试剂盒制作标准曲线，对各组免疫鸡分泌的IFN-γ进行检测。

1.5攻毒保护试验3免后2周时，各组免疫鸡肌肉注射禽P.multocida强毒CVCC474菌株进行攻毒，5LD50/只，观察2周，记录各组实验动物的死亡数量，计算各免疫组的存活率并按照如下公式计算各组的保护率：保护率=(免疫组鸡存活率-对照组鸡存活率)/100%。

2结果

2.1重组蛋白的纯化将重组菌经IPTG诱导表达后，利用His-Tag融合蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行纯化，进行SDS-PAGE分析。结果显示，纯化的rPtfA分子量约为33ku，与预期大小一致(图1)。

2.2血清抗体检测结果以禽P.multocida全菌体作为包被抗原进行间接ELISA试验检测各免疫组鸡血清IgG抗体水平，从首免后1周进行检测，共检测6周。结果显示，弱毒活疫苗组和rPtfA免疫组的血清抗体水平呈逐渐上升趋势，与PBS对照组相比差异极显著(p<0.01)，而且弱毒活疫苗组的血清抗体水平略高于rPtfA免疫组，但差异并不显著(图2)。

2.3MTT检测结果首次免疫后每隔2周，心脏采血制备免疫鸡外周血淋巴细胞悬液，以ConA蛋白进行刺激，MTT法检测其增殖情况。结果显示，rPtfA组和弱毒活疫苗组均出现增殖反应。第2周时各组的SI值差异不显著，第4周和第6周时rPtfA组和弱毒活疫苗组的SI值极显著高于PBS对照组(p<0.01)，并且弱毒活疫苗组稍高于rPtfA免疫组(图3)。

2.4IFN-γ分泌水平分别于首免疫后的第2周、第4周和第6周时，制备免疫鸡外周血淋巴细胞悬液，以ConA蛋白进行诱导，收集上清液，检测上清液中IFN-γ的含量，结果显示，首免后第2周两疫苗组和PBS对照组分泌的IFN-γ无明显差异；4周和第6周时两疫苗组免疫鸡外周血淋巴细胞分泌的IFN-γ的量显著高于PBS对照组(p<0.01)，虽然两疫苗组差异并不显著，但弱毒活疫苗组分泌的IFN-γ水平要稍高于rPtfA免疫组(图4)。

2.5攻毒保护结果各组实验动物于第3次免疫后2周时以禽P.multocida强毒株进行攻击。继续饲养观察2周，计算疫苗的保护率，结果显示rPtfA组和弱毒活疫苗组的保护率均明显高于PBS对照组，并且弱毒活疫苗组高于rPtfA组，各组存活数及保护率如表1所示。

3讨论

禽P.multocida引起的禽霍乱是影响禽类健康的重要疫病之一，用于预防该病的传统疫苗存在免疫期短，副作用较大等一系列问题，因此需要研制新型有效的疫苗。本实验构建了禽P.multocida菌毛蛋白编码基因ptfA的原核表达载体，在大肠杆菌感受态细胞中进行了表达，并对表达的重组蛋白进行了纯化。为进一步研究该重组蛋白的免疫原性，本实验利用该重组蛋白制备了油乳剂疫苗，进行了动物免疫和攻毒试验，检测了该重组疫苗诱导实验动物机体产生的体液和细胞免疫应答水平以及为实验动物提供的保护效果，从而为研制新型禽P.multocida基因工程亚单位疫苗提供了一定的参考。将制备的rPtfA亚单位疫苗免疫鸡后，通过间接ELISA试验检测了该疫苗诱导的抗体应答水平，结果表明该重组亚单位疫苗可以刺激机体产生一定水平的血清抗体。由于弱毒活疫苗所含成分较为复杂，利用其免疫动物后诱导机体产生的抗体是针对多种抗原成分的抗体混合物，而rPtfA亚单位疫苗成分较为单一，刺激动物机体产生的抗体主要针对于该重组蛋白。

实验中所用包被抗原为禽P.multocida全菌体，其中所含抗原成分与弱毒活疫苗较为接近，这可能是检测到弱毒活疫苗诱导的抗体水平高于rPtfA亚单位疫苗的原因之一。此外，本实验对疫苗免疫动物后的淋巴细胞增殖水平及IFN-γ分泌水平也进行了测定，结果表明该重组亚单位疫苗可以在一定程度上诱导免疫动物产生细胞免疫应答，但水平要低于弱毒活疫苗。为保证攻毒效果，采用5LD50的剂量以禽P.multocida强毒株进行攻毒后，结果各组的实验动物均出现一定数量的死亡，其中PBS对照组死亡数最多，但攻毒2周后该组仍有1只实验动物存活。分析其中的原因可能与实验动物的个体差异有一定的关系，也可能与动物的饲养环境有关系，本实验的动物饲养于微生物实验室中，该实验室保存有多种病原微生物、工业微生物和食品微生物。可能在饲养过程中有一部分此类微生物通过自然途径进入实验动物体内，若其中的某些微生物含有与禽P.multocida具有一定同源性的蛋白成分，则动物机体可能对此产生了一定程度的免疫应答，从而对禽P.multocida具有了一定的抵抗力。因此，在今后的动物实验过程中应重视饲养环境的洁净，以保证实验结果的准确性。攻毒后rPtfA组的保护率明显不及传统的弱毒活疫苗，其原因可能在于该重组蛋白所含抗原成分较为单一或者禽P.multocida菌毛蛋白的免疫原性不够强，不足以为实验动物提供较强保护力。因此，后续研究可尝试将ptfA基因与禽P.multocida的其他保护性抗原基因连接后制备多基因融合亚单位疫苗，以期提高其免疫效果。

作者：宫强孔梁宇牛明福秦翠丽侯颖孙晓菲单位：河南科技大学