猪源化抗体对杆状病毒的影响范文

《中国预防兽医学报》2014年第八期

1材料和方法

1.1轻链与重链全长基因的克隆将鉴定阳性的克隆质粒通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)扩增鼠-猪嵌合轻链和重链的全长基因，分别用LV-F/LC-R扩增轻链全长序列，用HV-F/HC-R扩增重链全长序列。PCR反应条件：94℃5min；94℃1min、56℃(轻链)30s/56℃(重链)1min、72℃(轻链)1min/72℃(重链)100s，共30个循环；72℃10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增的轻链与重链全长的基因片段进行胶回收，克隆于pMD18-T载体中进行测序鉴定。

1.2重组质粒的构建及鉴定将鼠-猪嵌合轻链全长序列(BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切)及鼠-猪嵌合重链全长序列(XhoⅠ/NheⅠ双酶切)分别克隆于pFast-Bac-Dual的两个启动子之下，并对重组质粒测序鉴定。

1.3鼠-猪嵌合单链抗体(scFv)的表达按照Bac-to-BacBaculovirusExpressionSystem操作指南进一步构建含有鼠-猪嵌合的轻链和重链基因的杆粒，并利用CellfectionⅡ转染试剂将其转染于Sf9昆虫细胞中，27℃培养拯救表达scFv的杆状病毒，当细胞病变(CPE)达80%以上，收集上清液和细胞。

1.4scFv的表达和纯化分别取上清液和沉淀，SDS-PAGE检测蛋白的表达情况，参照文献[8]的方法利用Ni-NTAPurificationSystem进行重组蛋白(scFv)的纯化。

1.5scFv的westernblot鉴定将重组杆状病毒感染的细胞裂解物经SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜上，采用含5%脱脂乳的PBST4℃封闭过夜。以纯化的scFv作为一抗(1∶100)，以羊抗猪IgG-HRP(1∶5000)为二抗，DAB试剂盒避光显色检测。

1.6scFv活性检测将H.parasuis分离株HLJ-018包被ELISA板，经5%脱脂奶粉封闭，以纯化scFv(1∶150)为一抗，以羊抗猪IgG-HRP(1∶10000)为二抗，TMB显色，酶标检测仪测量OD450nm值。

1.7scFv体外抑菌试验分别将PBS、MAb1D8和纯化的scFv与稀释HLJ-018菌液混合后置于37℃水浴锅中孵育1h，分别取出3种混合液100μL均匀涂布于TSA培养基上，37℃培养过夜进行菌落计数。

1.8scFv体内抑菌试验将18只6周龄的BALB/c雌鼠，随机分成3组，每组6只，腹腔被动免疫PBS、MAb1D8与纯化的scFv，接种后1h，分别腹腔注射处于对数生长期的致死剂量的HLJ-018(1010cfu/mL)。观察小鼠的死亡情况。

2结果

2.1鼠源抗体可变区轻和重链及猪源抗体恒定区轻和重链的扩增及克隆

2.1.1可变区轻和重链及恒定区轻和重链的扩增RT-PCR分别扩增鼠源抗体可变区轻、重链与猪源抗体恒定区轻、重链，分别得到预期目的片段，测序结果也与预期相符。

2.1.2重组质粒的构建采用SOE-PCR法扩增轻链与重链全长编码序列，电泳检测分别约为750bp和1300bp的两个DN段。

2.1.3重组质粒的构建及鉴定将全长鼠-猪嵌合抗体的轻链和重链编码序列经双酶切，分别克隆于pFast-Bac-Dual的两个启动子之下构建重组转移质粒。经双酶切鉴定结果显示，两个目的片段约为750bp和1500bp，与预期相符，并将其转化于E.coliDH10B中制备重组杆粒。

2.2鼠-猪嵌合scFv的表达及鉴定通过转染试剂，将重组杆粒DNA转染于Sf9昆虫细胞，27℃培养拯救重组杆状病毒，经过3次传代后细胞出现明显的CPE。当CPE达到80%～90%时，收集上清液和沉淀，SDS-PAGE检测鼠-猪嵌合scFv的表达；以羊抗猪IgG-HRP作为二抗，通过westernblot鉴定鼠-猪嵌合scFv的猪源部分恒定区。ELISA检测scFv的免疫原性将H.parasuis作为包被抗原，通过ELISA方法检测嵌合scFv与H.parasuis的特异性结合活性。结果显示，重组表达的嵌合scFv与H.parasuis能够特异性结合，表明独立表达的嵌合轻链和重链能够自主组合为具有特异性结合活性的scFv。

2.3scFv体外抑菌试验将纯化的嵌合scFv与处于生长期的H.parasuisHLJ-018株混匀，37℃水浴30min之后，涂布于TSA培养基上，37℃孵育过夜，然后进行细菌计数，结果显示，scFv具有良好的抑菌活性。

2.4嵌合scFv体内抑菌试验在BALB/c小鼠的腹腔中分别注射0.5mg纯化后的MAb1D8、纯化后的scFv和等体积的PBS，接种后1h，以致死剂量的H.parasuisHLJ-018株(1010cfu/mL)攻毒，观察小鼠的存活情况。结果表明，阴性对照组的小鼠在注射致死剂量的HLJ-018后18h，死亡4只；攻毒后32h，阴性对照组的小鼠完全死亡；嵌合scFv与MAb1D8组小鼠死亡时间均被推迟，而且半数小鼠被保护并存活。

3讨论

本研究通过以具有交叉保护作用抗H.parasuisMAb1D8的cDNA为模板扩增其轻、重链的可变区，作为构建scFv可变区序列，鼠源MAb可变区框架经BLAST筛选和确定后，设计引物可以扩增出目的序列。对于猪源恒定区的序列扩增，是将GenBank中收集的猪IgG序列进行比对，确定猪源抗体的恒定区序列，设计引物进行扩增获得恒定区全长。引物设计的准确与否直接关系到可变区与定区的扩增效率，并为进一步嵌合抗体的构建奠定了基础。抗体的轻、重链是通过二硫键的作用结合到一起的，本研究利用pFast-Bac-Dual穿梭质粒，构建双向表达重组质粒。最终表达的scFv，经过westernblot、ELISA验证后，结果表明，构建表达的重组蛋白具有特异性的抗原结合活性。效力验证分别通过体内、外的抑菌试验进行。体外抑菌试验表明，scFv具有识别并抑制H.parasuis生长的能力；小鼠的体内抑菌试验结果显示，MAb1D8和scFv组的小鼠与阴性对照组的小鼠相比，死亡时间延长，死亡比例降低。本研究构建的猪源scFv对于H.parasuis的感染具有明显的保护作用，可以作为潜在的治疗生物制剂进一步研究。

作者：杨玉菊姜福成柴政符芳郑楠王香玲郭殿磊李曦单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室 猪传染病研究室哈尔滨学院