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HP—PRRSVN蛋白的免疫检测

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《中国兽医学报》2014年第七期

1间接ELISA的建立以及条件优化

1.1采用方阵加样法,对梯度稀释的包被抗原、梯度稀释的血清进行间接ELISA,利用酶标仪测定各微孔的D450,选定最适的抗原包被浓度和血清稀释度。

1.2分别按照4℃过夜、37℃1h、37℃2h,进行ELISA测定,每孔重复测定3次,选择最佳包被条件。

1.3根据实验室经验,分别选择0.1%、0.5%、1%的BSA,0.1%、0.5%、1%的脱脂奶粉作为封闭液封闭1h,选择合适的封闭液种类和浓度。

1.4分别用以上得到的封闭液种类和浓度进行封闭0.5、1、1.5h,选择合适的封闭液时间。

1.5将兔抗猪IgG用稀释液作1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000系列稀释,选择最佳工作浓度。

1.6将兔抗猪分别孵育0.5、1.5、2h,确定二抗的最佳孵育时间。

1.7计算间接ELISA检测临界值取30份PRRSV阴性血清按优化条件,在选择好的条件下进行间接ELISA测定,求D450平均值和标准误差。临界值=x+3×sx。

1.8特异性试验按优化的间接ELISA操作步骤,用胸膜肺炎阳性血清、猪圆环病毒病阳性血清、猪伪狂犬阳性血清、猪瘟阳性血清进行ELISA检测,每份血清重复检测4孔,同时PRRSV阴、阳性血清(美洲型)各1份作对照组。通过D450来判定阴阳性结果,以此来判定特异性。

1.9敏感性试验将阳性和阴性血清从1000倍作二倍比稀释,将P/N值>2.0的最大血清稀释度作为其灵敏度。进行批内重复和批间重复

1.10重组N蛋白包被板保存期的确定用同一批制备的N蛋白包被板条,并分为干板包被和湿板包被,按己建立的间接ELISA方法每周进行检测,PRRSV阴、阳性血清每板分别重复5孔,结果取平均值。每周l次,共检测6次。

将提纯的N蛋白作为抗原,免疫6~8周龄BALB/c小鼠3只,共免疫4次,每次间隔2周。用间接ELISA检测可用后去眼球放血处死小鼠,进行细胞融合,筛选阳性融合细胞并进行亚克隆;挑选经产BALB/c小鼠,腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL/只。10~14d后,将筛选出的杂交瘤细胞注射至小鼠体内。每只小鼠腹腔接种杂交瘤细胞(1~3)×106个。7~10d后,采集腹水。采用辛酸硫酸铵沉淀法对腹水进行纯化,并对单克隆抗体进行效价、亚类和特异性的鉴定。

1.11胶体金试纸条条件选择以及制备采用柠檬酸三钠反应法制备直径约为20nm的胶体金颗粒。取10支EP管,每管加1mL制备好的胶体金溶液;用0.1mol/LK2CO3调节溶液的pH值:在1~10号管内分别加入3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μL的0.1mol/LK2CO3,混匀,室温静止10min;每管加入1g/L的8号抗体10μL,即每管加入抗体10μg,摇匀,室温静止10min;然后每管加入0.1mol/LNaOH50μL,摇匀,室温静止2h后观察结果。溶液颜色没有变化的即为胶体金的最适pH值。另取6支EP管,每管加入1mL制备好的胶体金溶液;用0.1mol/LK2CO3调节溶液至最适pH值,摇匀,室温静止10min;在1~6号管内分别加入1g/L的8号抗体2、3、4、5、6和7μL,摇匀,室温静止10min;然后每管加入0.1mol/LNaOH50μL,摇匀,室温静止2h后观察结果。以稳定1mL胶体金溶液颜色不变的最低抗体量为该抗体的最低用量,在实际工作中,需增加10%~20%以确保溶液稳定。按金标抗体的制备流程标金,随后用金标工作液将金标McAb作1∶2、1∶4、1∶8、1∶10、1∶20稀释,在玻璃纤维素膜上按每平方厘米铺31μL的金标抗体溶液进行铺金,其他条件不变,观察试验结果。

2结果

2.1N蛋白的纯化和特异性

2.1.1N蛋白的纯化用Elutionbuffer洗脱所得的流通液含目的蛋白量较大,可达到90%以上的纯度,且杂蛋白量少,达到预期效果(图1)。2.1.2纯化后N蛋白的Westernblot将菌体全蛋白和纯化后的N蛋白转膜进行之后的Westernblot检测,结果见图2,在图中看见在菌体全蛋白和纯化后N蛋白液中均在17000处有明显条带,且纯化后的N蛋白只有1条条带,表明纯化后的N蛋白特异性很好。

2.2间接ELISA各条件的优化结果及性能测定

2.2.1优化结果确定抗原包被浓度为1g/L、检测血清稀释倍比为1∶800、包被条件为4℃过夜、以1%的BSA作为封闭液、封闭条件为37℃,1h、37℃0.5h,2000倍稀释作为兔抗猪IgG最佳工作条件。

2.2.2临界值的确定按照间接ELISA基本的步骤,利用优化条件进行ELISA测定,对30份的已经测定为阴性的血清进行试验测定。由数据计算可得:D450平均值=0.213180104,标准差=0.002223016临界值=0.219849当测定样品的D450值>0.219849时,则样品判定为阳性;当测定样品的D450值<0.219849时,样品判定为阴性。

2.2.3特异性试验结果用上述建立好的ELISA方法检测由石家庄市畜禽疫病防治站提供的胸膜肺炎阳性血清、猪圆环病毒病阳性血清、猪瘟阳性血清、猪伪狂犬阳性血清,每份血清重复检测5孔,同时PRRSV阴、阳性血清(美洲型)各取1份作为对照组,通过表1中D450值判定各抗原间不存在交叉反应(表1)。

2.2.4敏感性测定结果将阳性血清,阴性血清同时稀释,从稀释1000倍开始做二倍比稀释,至20000倍时,阳性血清D450依然在0.5以上,S/P值大于2.1,而阴性值已经趋于平衡并且数值很小,故没做更大倍数的稀释,只稀释至20000倍。

2.2.5批内的检测试验用同一时间制备的N蛋白进行包被,按上文优化的条件来实施间接ELISA检测,PRRSV阴、阳性血清每板检测分别做5复孔,重复检测5次。结果取其平均值。在其他条件不变的情况下,根据表2中D450值,计算得到:批内的变异系数结果为小于7%。说明同一时间制备的N蛋白在ELISA的试验中变异的程度相对较小,重复性相对良好。

2.2.6批间的检测试验用不同时间制备的N蛋白包被板条,按上文优化的条件来实施间接ELISA检测,PRRSV阴、阳性血清每板分别做5复孔,共检测5板。结果取平均值。在其他条件不变的情况下,根据表3中D450值,计算得到:批间的变异系数结果为小于7%。说明不同时间制备的N蛋白在ELISA的试验中变异的程度相对较小,重复性相对良好(表3)。

2.2.7保质期试验湿板包被比干板包被效果好,并且3周之内可以用来检测,3周后建议不使用,或者现用现包被也可。

2.3单克隆抗体纯化和鉴定

2.3.1单克隆抗体的纯化细胞融合后第8天观察时可见明显的细胞群,计算融合率=324/384=84.38%,阳性率=176/384=44.79%。使用间接ELISA对杂交瘤细胞进行必须的筛选,经4~5次亚克隆共得到12株阳性的杂交瘤细胞系。以N蛋白为免疫原共获得10株杂交瘤细胞。同时获得2株抗组氨酸标签的杂交瘤细胞。利用辛酸硫酸铵沉淀获得纯化抗体,SDA-PAGE电泳结果如图(图3),因后续试验检测出第十个抗体不与商业化试剂盒PRRSV抗原反应,故图中没有第十个抗体。

2.3.2单克隆抗体特性鉴定利用sigma抗体亚型试剂盒鉴定10株抗体,抗体亚型均为IgG1型,无IgM型。

2.3.3单克隆抗体的特异性用N蛋白和其他融合蛋白进行ELISA试验对结果进行比较,最终筛选出10个针对N蛋白的抗体和两个针对组氨酸标签的抗体。利用PRRSV商品化试剂盒对所得10个单克隆抗体进行检测,其中1号至9号均与试剂盒中的PRRSV病毒反应,结果为阳性;10号抗体结果为阴性,故10号抗体弃之不用于后续试验。使用间接ELISA方法测定伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2(PCV2)、猪瘟病毒(HCV)与所得单克隆抗体的反应,并且用N蛋白做阳性对照。结果显示这些病毒均无阳性反应,说明所获得的9个单克隆抗体的特异性很好。

2.4胶体金试纸条条件优化、组装和特性检测

2.4.1胶体金的质量检测肉眼观测法鉴定:观察制备好的胶体金溶液,见图4A,可见溶液清晰通亮,颜色呈酒红色,且色泽均匀,无分层现象,无固体沉淀产生。利用透射电镜,对胶体金进行扫描,图4B可看到大小为20nm的金颗粒,形状均匀,无三角或者多边形产生。

2.4.2McAb(4G3A1)最适pH和最适标记量最适pH值观察结果见图5,从图中可见编号为8的EP管中的胶体金溶液颜色未发生明显的变化,依然与最开始配制时的颜色基本保持不变,而此EP管内加入0.1mol/LK2CO3的量为10μL,故1mL配制好的胶体金溶液需加入10μL0.1mol/LK2CO3达到最适pH值,以保持溶液的稳定。利用预试验中反应良好的McAb(4G3A1)和胶体金溶液进行结合,McAb最适标记量如图6所示,1、2号EP管内的胶体金液体从红色变为蓝色,说明抗体量不足,不能稳定EP管内的胶体金溶液。从3号开始,EP管内的胶体金溶液颜色未发生明显的变化,依然与最开始配制时的颜色基本保持不变,而3号EP管内加入抗体的量为4μg,故1mL配制好的胶体金溶液最少需加入4μg的McAb(4G3A1)达到最适标记量,以保持胶体金溶液的稳定。在实际大量制备金标抗体时,在此剂量的基础上再增加10%~20%即可使用。

2.4.3金标McAb(4G3A1)最适稀释倍数的确定将制备好的金标McAb(4G3A1)用金标稀释液稀释成不同倍数,进行检测,观察试纸条的条带显色情况,“+++”表示条带颜色深,背景色干净,“++”表示条带颜色较深,或者背景有颜色,或滞留金现象,“+”表示有浅色带,或有很强的背景色,“-”表示无带。通过表4比较,1∶2和1∶4稀释的金标抗体试验条带显色很深,但是有部分滞留金的现象,污染背景色;1∶8和1∶10稀释的金标试验条带显色很深,且无滞留金现象;1∶20稀释的金标抗体试验条略浅。故选择1∶10稀释金标McAb(4G3A1)。

2.4.4NC膜抗体最适包被量的确定按照最适稀释倍数稀释金标McAb(4G3A1),然后分别稀释兔抗PRRSVN蛋白抗体、兔抗鼠IgG,结果显示见表5,当包被量为0.2g/L时,条带有变浅的趋势,故选择0.3g/L为最适NC膜的抗体包被量。

2.4.5特异性检测用组装好的试纸条检测PRRSV病毒(美洲型)、胸膜肺炎菌、圆环病毒、猪瘟抗体量不足,不能稳定EP管内的胶体金溶液。从3号开始,EP管内的胶体金溶液颜色未发生明显的变化,依然与最开始配制时的颜色基本保持不变,而3号EP管内加入抗体的量为4μg,故1mL配制好的胶体金溶液最少需加入4μg的McAb(4G3A1)达到最适标记量,以保持胶体金溶液的稳定。在实际大量制备金标抗体时,在此剂量的基础上再增加10%~20%即可使用。病毒、伪狂犬病毒和0.02mol/LPB,结果如图4,只有PRRSV的检测线有条带显示,其他的检测线均无条带,说明该试纸条与其他猪类病毒无明显交叉反应。

2.4.6保存期试验将免疫胶体金诊断试纸条置于4℃条件下,放置3个月,每隔2周进行检测,每次3条。结果表明3个月内试纸条的T线和C线明显清晰,且释放金的速度都控制在5min之内,5min内金全部释放完并且可观察到结果。

3讨论

3.1关于胶体金溶液pH调节的方法的改进利用柠檬酸三钠法制备20nm金颗粒的研究有很多[12-14],在后续试验中为了稳定胶体金液体,通常涉及到pH调节问题,本试验不再拘泥于pH的具体数值,而是通过给出K2CO3的所需量来对pH进行调节。因为本身胶体金溶液pH的调节就是1个相对麻烦的过程,溶液会对pH仪器的探头产生损害,而且每个仪器还都会有相对的差别,因此选用这种方法,即避免了仪器损伤,又忽略了仪器质检的偏差,而且更加适用于大范围溶液的制备过程。

3.2本试纸条与国内外相关方法的比较免疫胶体金研究与ELISA试验相似,也有经常利用的蛋白,N蛋白和M蛋白的单克隆抗体就是胶体金研究常用的蛋白:方莹等[15]第一次应用了免疫胶体金试纸技术对PRRSV病毒进行快速检测方法:分别把胶体金PRRSV、兔抗PRRSV抗体和PRRSV喷在玻璃纤维和硝酸纤维素膜的对照线和检测线上,这些构成免疫金标试纸的主要部分,随后再与美国IDEXXPRRSVKit相比较,结果相差不大。崔尚金等[16]用重组N蛋白研发了PRRSV免疫胶体金抗体的检测技术;周胜华等[17]利用抗M蛋白和抗N蛋白的单克隆抗体,检测病料中的PRRS病毒。该方法只能用于检测中国已经存在的PRRSV毒株而不能用于检测欧洲型毒株[18]。本试验参照上述方法利用重组蛋白制备胶体金试纸,用于检测相关的国内病毒,并进行了较为详细的步骤叙述,使得结果更为信服。在后续的试验中,希望检测范围得以扩大。

作者:姚瑶赵宇亮王勇鑫 赵宝华单位:河北师范大学生命科学学院

中国兽医学报责任编辑:田老师    阅读:人次
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