中药方剂发酵前后成分分析范文

1发酵前后甘草次酸含量变化

1.1色谱条件色谱柱ChromsphereC18柱(150mm×4.6mm，5μm)、流相乙腈-水-甲醇(7:2:1)、流速0.8ml/min、检测波长268nm、柱温室温、进样量20μl。

1.2标准品溶液的配置精密称取甘草次酸对照品约10mg，用甲醇适量超声溶解，加甲醇至刻度，摇匀，配成甘草次酸对照品溶液。再精密吸取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml，置量瓶中，配成各个浓度的甘草次酸标准品溶液。

1.3标准曲线的绘制分别取各个浓度的甘草次酸对照品溶液20μL，依次进样，测定峰面积，记录色谱图及色谱峰面积，以进样量(μg)对峰面积进行线性回归，得标准曲线方程为Y=1341206.1X+87543.5(相关系数r=0.9996)，线性范围为0.0768~1.2288μg。

1.4样品处理方法中药提取液、发酵液的处理方法：分别取中药提取液和发酵液10ml，加入5%的盐酸20ml，摇匀10min，分别离心10min，6000r/min。取上清液10ml，用氯仿萃取3次，20ml/次。合并萃取液，蒸干，用甲醇溶解，定容到50ml容量瓶中。

1.5精密度试验取标准品溶液，分别连续进样5次，每次进样20μl，记录吸收峰面积，测定结果RSD为0.22%。

1.6稳定性试验取供试样品溶液，室温放置，每2h上样1次，记录锋面积，测定结果RSD为1.87%。说明样品在12h内稳定。

1.7重现性试验根据样品处理方法，分别制备供试样品，每个样品制备6分。分别测定含量，测定结果药渣的RSD为1.74%，发酵产物的RSD为1.58%。

1.8加样回收试验取已知含量的提取液和发酵产物样品，精密称定5份，置于锥形瓶中，分别加入甘草次酸对照品溶液，分别处理样品。测定样品中甘草次酸含量，结果如表1、2。

1.9含量测定按照设定的色谱条件和标准曲线计算，提取液和发酵产物中各3批产品中甘草次酸的含量，结果如表3。

2发酵前后黄芩苷、黄芩素的变化

2.1色谱条件色谱柱ChromsphereC18柱(150mm×4.6mm，5μm)、流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(51:49)、检测波长277nm、流速1.0ml•min-1、柱温25℃，理论塔板数按黄芩苷峰，黄芩素峰计算应不低于2500。

2.2对照品溶液的制备黄芩苷对照品溶液制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含25μg黄芩苷的对照品溶液，摇匀，既得。黄芩素对照品溶液制备：取黄芩素对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含100μg黄芩素的对照品溶液，摇匀，既得。

2.3供试样品的制备中药提取液、发酵液的处理方法：分别取中药提取液和发酵液，分别离心10min，6000r/min。取上清液5ml，转移置于25ml容量瓶中，加无水乙醇5ml超声溶解，加入无水乙醇定容。从容量瓶中移取5ml至50ml容量瓶中，用70%的乙醇定容。

2.4检测波长的确定黄芩苷与黄芩素对照品经DAD检测器进行紫外吸收光谱扫描，二者均在277nm处有最大吸收，故检测波长确定为277nm。

2.5专属性试验按处方比例配制缺黄芩的阴性样品，制备样品溶液，根据色谱条件测定，结果黄芩苷和黄芩素对照峰处均未出现色谱峰，说明发酵液和提取液中其他成分对黄芩中黄芩苷和黄芩素的测定均无干扰。

2.6线性关系考察（1）黄芩苷的标准曲线：精密称取黄芩苷对照品4.08mg，置100ml量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为40.8μg/ml的溶液。分别稀释成浓度为10.2、15.3、20.4、25.5、30.6、35.7μg/ml。精密吸取上述6个浓度对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，按色谱条件测定峰面积。以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。结果表明：黄芩苷在0.102~0.357μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，其回归方程Y=33309.29X+2233.611(r=0.9999)。结果见图3。（2）黄芩素的标准曲线：精密称取黄芩素对照品13.43mg，置25ml量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为0.537mg/ml的溶液。分别稀释成浓度为53.7、107.4、214.8、322.2、429.6、537.0μg/ml。精密吸取上述6个浓度对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，按色谱条件测定峰面积。以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。结果表明：黄芩素在0.537~5.370μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y=51392.68X-666.28(r=0.9998)。结果见图4。

2.7稳定性试验制备供试品溶液，室温下放置，分别于0、1、2、4、6、8、10、12、24h后依次注入液相色谱仪，测定黄芩苷与黄芩素的峰面积并计算RSD值。黄芩苷与黄芩素的RSD分别为0.22%和0.52%，结果表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.8精密度试验取样品，制备供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积值并计算RSD值。黄芩苷和黄芩素的RSD分别为0.26%和0.53%，结果表明仪器的精密度良好。

2.9重复性试验取同一批号样品，制备供试品溶液6份，测定其含量及RSD值。黄芩苷和黄芩素的含量分别为1.31mg/g(RSD=1.09%)，8.43mg/g(RSD=0.48%)。结果表明该方法重现性良好。

2.10回收率试验（1）黄芩苷回收率试验：称取已知含量的同一批供发酵液和提取液各1ml(5份)，精密称定，分别精密加入黄芩苷对照品，测定黄芩苷含量，计算回收率，结果见表4、5。（2）黄芩素回收率试验：称取已知含量的同一批发酵液1ml(5份)，精密称定，分别精密加入黄芩素对照品，测定黄芩素含量，计算回收率。结果见表6、7。

2.11黄芩苷、黄芩素在发酵液和提取液中的含量分别取3批中药发酵液和提取液各2ml，处理样品，进入高效液相，测定含量。

3结论

从试验结果来看，发酵液和提取液中均有柴胡皂苷a,柴胡皂苷d的薄层特征，并且发酵液中的薄层点要比提取液多两个，并且特有的斑点移动距离大于柴胡皂苷a和d，这说明这两种物质的极性、分子量小于柴胡皂苷，根据相关文献报道，这两种物质疑似柴胡皂苷a和d的苷元。从液相测定的甘草次酸、黄芩素、甘草酸、黄芩苷的含量来看，通过发酵后甘草次酸、黄芩素含量升高，而甘草酸和黄芩苷含量降低，通过研究发现甘草次酸和甘草酸的区别就是，甘草次酸比甘草酸少了一个葡萄糖，而黄芩苷和黄芩素的区别也是如此，黄芩素、甘草次酸、柴胡皂苷苷元，在肠道内可以不经过肠道微生物的分解，直接吸收进入血液，药效要比黄芩苷、甘草酸、柴胡皂苷快，因此，通过生物发酵提高了中药的药效，加快了中药的作用速度。

作者：范作良 刘英龙 鞠 雷 李汝春 贾慧卿 单位：山东畜牧兽医职业学院 潍坊诺达药业有限公司