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斑马鱼体内喹乙醇的检测技术研究

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《中国抗生素杂志》2016年第二期

摘要:

目的优化鱼体内喹乙醇及代谢物的检测技术,探明兽药抗菌剂喹乙醇的生物富集特性。方法选择斑马鱼作为受试生物,通过检出效率试验确定了斑马鱼体内喹乙醇及代谢物MQCA的检测方法;采用半静态试验测定了2个暴露水平下喹乙醇的生物富集特性。结果乙腈超声提取-柱层析净化-高效液相色谱/质谱联用测定法(HPLC/MS)可同步检出斑马鱼体内喹乙醇及代谢标志物MQCA的含量;斑马鱼体内喹乙醇在的最大富集量分别出现在第4天(暴露浓度0.25mg/L)和第6天(暴露浓度1mg/L),生物富集系数为0.18~0.30,实验期内代谢物MQCA的最大残留浓度为0.013~0.016mg/kg,出现在第2天(喹乙醇暴露浓度1mg/L)和第4天(喹乙醇暴露浓度0.25mg/L)。结论本文建立的喹乙醇及其代谢物的检测技术准确可靠,单一水溶液暴露方式下斑马鱼对喹乙醇的富集性较低,本研究为该类药物的慢性毒性评价提供了基础数据支撑。

关键词:

喹乙醇;MQCA;检测方法;生物富集

喹乙醇(olaquindox,简称OLA)又名喹酰胺醇,为纯化学合成类广谱抗菌药,对鱼类的致病菌革兰阴性菌、衣原体、螺旋体及放线菌等均具有良好的抑制和杀灭作用[1-2]。同时也被广泛用作水产养殖及畜禽养殖的饲料添加剂[3-4]。近年的生态毒理学研究表明,长期大剂量的使用OLA会导致生殖鱼类中毒,抗应激能力低下,出现“应激性出血”并发生大量突发性死亡,给养殖业造成较大损失[5-6];又因OLA具有致突变、致癌和生殖毒性等危害,在美国和欧盟禁止将其用作饲料添加剂,在国内OLA被禁止用于家禽及水产养殖。3-甲基-喹噁林-2羧酸(MQCA)是OLA的主要代谢物,其在鱼体内相对稳定,是国际食品法典委员会认定的残留标识物[7]。由于OLA广泛应用带来的影响和危害较大,因此,开展OLA及MQCA的环境检测研究尤为重要。然而关于OLA及其代谢物MQCA的同步检出研究的未见报道;同时,目前关于鱼体内OLA的蓄积研究多采用饵料投喂及肌肉注射(腹腔注射)的方式进行,其生物富集特性的研究未见明确报道。为探明OLA在标志性水生生物-斑马鱼体内的生物富集特性,本实验采用水溶液暴露的研究方式,首先研究了斑马鱼体内OLA和MQCA的同步检出技术,后参照《化学农药环境安全评价试验准则第7部分:生物富集试验》[8]进行8d的生物富集试验,以期为OLA的慢性毒性测试及病理学测试提供参考。

1仪器与试剂

1.1实验材料实验用斑马鱼(Brachydaniorerio)取自中国科学院水生生物研究所,实验开始时鱼体长(连尾)2~3cm,体重约0.10~0.20g/尾,每一试验浓度的试验鱼50尾。试验前在室内驯养一周,预养期间斑马鱼生长正常,无死亡。OLA(纯度99%)、MQCA(纯度95%),均由德国Dr.Ehrenstorfer生产;实验用甲醇、乙腈,正己烷均为色谱纯,德国Merck试剂公司生产;无水硫酸钠,硫酸锌,中性氧化铝均为分析纯,国药集团上海试剂厂生产。

1.2实验仪器Waters超高效液相色谱-串联质谱仪(HPLC-MS,AcquityQuattroMicro),工作站Mslynx4.1,美国Waters公司制造;超声波提取器,KQ-50DA,昆山市超声仪器有限公司制造;旋转蒸发仪,N-1001,日本EYELA制造;超纯水仪,AdvantageA10,美国MilliQ公司生产。

2方法与结果

2.1水和鱼体中OLA的检测水中OLA和MQCA的检测采用0.22μm水相滤膜过滤后进液相色谱-质谱测定的方法。鱼体中OLA的检测通常需经过提取-净化去蛋白杂质-(浓缩)-HPLC/MS的过程,提取方式主要有快速溶剂提取[9](E),超声提取[10](SSE)等方式;MQCA通常采用碱液提取的方式[11]。兼顾提取效率和操作可行性,并实现OLA和MQCA的同步检测,本实验采用了超声热提取的方式;同时,由于斑马鱼个体较小,组织构成同其他鱼类、畜禽也有较大不同,本实验对提取、净化的过程进行了优化,以获得准确可靠的检测方法。

2.1.1超声提取功率的筛选鱼样采集后,采用玛瑙研钵将其研成肉沫状,以乙腈作为提取溶剂,用量20mL/次,提取两次;提取温度为40℃,分别在40%、60%和90%的超声功率下进行提取(每个功率下设置3个平行),提取时间选择15min。提取完成后,采用过无水硫酸锌+中性氧化铝去杂质的净化方式,净化液经旋转蒸发浓缩、乙腈定容,用HPLC-MS测定。

2.1.2净化剂的筛选在优化的超声提取条件下,比较液-固萃取和液-液萃取的净化效率,即分别采用无水硫酸锌+中性氧化铝+无水硫酸钠和正己烷去脂去蛋白的净化方式,净化液经旋转蒸发浓缩后,以乙腈定容、HPLC-MS测定。整个实验过程采用避光的措施,以降低OLA见光分解的影响。

2.1.3HPLC-MS测试条件HPLC条件分别配制1.0ppm的OLA和1.0ppmMQCA的乙腈-水溶液,选择WatersAcquityUPLCC18色谱柱(50mm×2.1mm,1.7μm),流动相为甲醇:0.1%甲酸=50:50,流速为0.1mL/min,进样量5μL,柱温30℃。MS条件:ESI方式,正离子扫描,毛细管电压310kv,离子源温度120℃,脱溶剂气温度350℃,脱溶剂气流量600L/h,锥孔气流量50L/h。多反应监测(MRM)模式下定量分析时母离子、子离子、碰撞电压及能量见表1。

2.2生物富集试验方法

2.2.1试验浓度的设定本研究中,预设试验安全浓度为10mg/L,进行96h急性毒性测试。经过96h毒性测试,未见受试斑马鱼死亡。权衡喹乙醇的水溶性和对比度要求,选择1/10和1/40的两个浓度水平:即1.0和0.25mg/L作为生物富集试验浓度。

2.2.2富集试验考虑受试物OLA具有易光解的特性,参照相关准则,采用半静态试验法每24h更换一次药液。设定的1.0和0.25mg/L的两个处理,每个处理设2个平行,溶液体积为10L,受试鱼50尾。同时作不添加受试药的空白对照。在试验开始后的0、24、48、96、144和192h采集水样和鱼样,检测其中OLA和MQCA的含量。

2.2.3数据处理若实验结束时鱼体中农药含量变化已达到平衡,则鱼体对供试物的富集系数按公式(1)计算。如果在试验结束时,鱼体中农药浓度尚未达到平衡,则用上述公式求出的富集系数值用8d的结果BCF8d表示。此外,数据的统计分析采用Excel软件,应用“公式”功能对平均值和相对标准偏差(RSD)进行模拟计算。

2.3结果

2.3.1HPLC-MS定量分析OLA及MQCA以乙腈-水(V:V=1:1)配制质量浓度为0.01~1mg/L的OLA和MQCA系列标准溶液,经过HPLC-MS测试,采用外标法定量,获得OLA测定的标准曲线方程为:y=1075x-12.612,线性系数r=0.9992;MQCA的标准曲线方程为y=2232.7x-35.464,线性系数r=0.9998(图1)。由结果可见,在0.01~1mg/L的浓度范围内,两种受试物的HPLC-MS测试符合线性方程,该工作曲线可用于生物富集实验浓度的计算。

2.3.2斑马鱼内目标物提取净化方式的优化(1)超声效率的比较通常采用热水或在适度增温的条件下进行鱼体内OLA的提取,采用正己烷或固相萃取柱进行净化[10-11];同时,对于MQCA的提取,通常采用酸水解、碱水解或酶解的方式[12]。而为实现OLA和其代谢物的同步提取,提高提取效率,本实验采用乙腈做提取剂,设计40℃提取温度,设置40%,60%和90%3个超声功率,对斑马鱼体内OLA和MQCA的提取效率试验结果见表2。由表2可知,2个添加水平下,60%的超声提取功率提取鱼体中OLA和MQCA的效率最高,OLA的回收率在72%~75%;MQCA的回收率在94%~102%。40%的超声功率偏低,可能会使受试物提取不完全;90%的超声功率偏高,会造成受试物分解导致提取效率下降。(2)净化方式的影响60%的超声功率下,分别采用无水硫酸锌+中性氧化铝+无水硫酸钠和正己烷去除杂质脂肪和蛋白,获得的回收率试验结果见表3。鱼类的脂肪和蛋白均会对目标物的测定产生一定的影响:或干扰仪器测定的基线导致检测限降低,或使定容液分层干扰测定结果。选择合适的净化方式可提高测定的准确度和精密度。通过对比净化效率,表明无水硫酸锌+中性氧化铝+无水硫酸钠的净化方式提取鱼体中的OLA效率更高,方法稳定性也更高;对于MQCA,正己烷去杂质的效果更高,回收率可达90%~112%,无水硫酸锌+中性氧化铝+无水硫酸钠的回收率在75%~76%,也可满足测定要求;从方法的稳定性比较,后者的稳定性更高。综合考虑,应选择无水硫酸锌+中性氧化铝+无水硫酸钠的净化方式。按照以上的提取净化方法进行检测限测试,确定方法的检测限为水中3μg/L,鱼体4μg/kg,可满足富集试验测试需求。

2.3.3生物富集实验结果(1)OLA在斑马鱼体内的生物富集特性8d的生物富集周期内,2个测试浓度下OLA的生物富集特性实验结果见图2。由图2可见,在0.25mg/L的暴露条件下,OLA在鱼体内的最大富集量出现在第4天,生物富集系数BCF值为0.30;在1mg/L的暴露条件下,OLA在鱼体内的最大富集量出现在第6天,生物富集系数BCF值为0.18,参照相关评价标准,在本实验条件下,OLA对斑马鱼的生物富集性为低富集性。实验过程中未有斑马鱼死亡,空白对照组中未检出受试物,试验期间,溶液pH值范围在6.98~7.27;温度在24.7℃~25.2℃,DO变化范围为4.7~5.5mg/L,本试验结果表明,相比其他有毒化学品[13-14],OLA的生物富集性较低。(2)代谢物MQCA在鱼体中的产生变化规律在8d的生物富集周期内,斑马鱼体内的MQCA残留状况测试结果见图3。由图3可见,在0.25mg/LOLA的暴露浓度下,MQCA在鱼体内的最大残留量出现在第4d,残留浓度为0.013mg/kg;在1mg/L的OLA暴露浓度下,MQCA在鱼体内的最大残留量出现在第2d,残留浓度为0.016mg/kg。可见MQCA在鱼体内产生浓度较低,对水体中MQCA的跟踪监测表明,水体中浓度≤0.001mg/L。

3讨论

鉴于OLA的毒性和潜在危害,关于其及代谢物MQCA的检测、生态毒理学等生态安全性评价研究也越来越深入。曾静等[10]报道采用60℃热水作为提取剂,并用乙腈和正己烷去脂和去蛋白并采用HPLC-MS进行测定,方法检出限为10μg/kg;谢小华等[11]采用乙腈作为提取剂,正己烷去脂,HPLC-UV检测,方法检出限为2μg/kg;对于MQCA的提取,碱水解反应剧烈,且反应后需调节pH值至中性,酶解条件温和,但需较长反应时间;吴玉杰[12]报道了检测鱼体中MQCA的方法,样品在酸性条件下水解,经乙酸乙酯、磷酸盐缓冲液依次提取,OisMAX固相萃取柱净化,紫外检测器检测。方法检出限为2.6μg/kg。于海霞[15]采用碱水解-高效液相色谱法检测草鱼肌肉组织中的MQCA,方法检出限为4.0μg/kg,回收率在80.5%~86.5%。相比以上方法,本实验采用超声热提取-柱层析净化-HPLC/MS的检测方式,操作更为简便,在保证低检出限和高稳定性的前提下,可实现OLA和MQCA的同步检出,提高了方法的效率和经济性。

徐韵等[16]研究了OLA对水生生物的毒理学,96h的急性毒性实验表明其对生生物为低毒。汪开毓等[17]腹腔注射法测得OLA在鲤鱼体内的蓄积系数为1.45~1.90。杨先乐等[18]采用饲料投喂法测定OLA在鲤和银鲫体内的蓄积,证明其在不同器官组织中的蓄积量在0.11~10.10mg/kg。统计分析数据表明在以上暴露方式下喹乙醇具有中度至明显的蓄积毒性。在本研究中采用直接水溶液暴露的染毒方式,获得的斑马鱼生物富集系数为0.18~0.30。同时发现不同的OLA暴露水平下,鱼体中OLA的富集浓度均是呈现先上升,后逐渐降低的趋势;作为OLA的主要代谢物,鱼体中MQCA残留浓度的变化趋势是先增大,而后略降低并达到平衡状态,同时由于OLA较低的生物富集性,其在鱼体内的富集浓度并不是随其溶液中暴露浓度增大呈线性增加,甚至在低暴露浓度下的富集性更高,导致其代谢物MQCA的平衡浓度差距不大。上述结果也表明了染毒方式不同,化学污染物在生物体内的富集结果也有较大的差别。本试验结果为OLA对生物体的慢性毒性评价提供了基础数据,围绕本实验结果可进一步讨论在水溶液暴露染毒方式下,慢性蓄积毒性的状况。

作者:孔祥吉 王娜 许静 郭欣妍 孔德洋 单正军 单位:环境保护部南京环境科学研究所 国家环境保护农药环境风险评价与污染控制重点实验室

中国抗生素杂志责任编辑:杨雪    阅读:人次
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