大鼠终板软骨细胞抗氧化能力研究范文

《中国脊柱脊髓杂志》2016年第三期

【摘要】

目的：通过研究不同年龄大鼠的终板软骨细胞氧化应激的差异，探讨衰老对终板软骨细胞抗氧化能力的影响。方法：原代培养获取SD大鼠2个月、18个月来源的终板软骨细胞鉴定后，使用第三代细胞进行实验。实验分为两组，A组为2个月大鼠来源的终板软骨细胞，B组为18个月大鼠来源的终板软骨细胞。待A、B两组细胞贴壁后，通过β-半乳糖脱氢酶染色和RT-PCR对端粒酶长度进行检测，比较两组细胞衰老的差异；通过总抗氧化能力试剂盒检测两组细胞总抗氧化能力的不同。以浓度为200umol/L过氧化氢对细胞进行2.5h的处理，RT-PCR法检测处理前后两组细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、caspase-3及B淋巴细胞瘤-2（B-celllymphoma-2，bcl-2）的mRNA表达情况，使用流式细胞仪检测两组细胞的凋亡情况。对Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、caspase-3及bcl-2的相对表达量进行组间t检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果：未使用过氧化氢处理时，A、B两组终板软骨细胞的在β-半乳糖脱氢酶染色、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达及凋亡率无明显差异（P>0.05），而B组在端粒酶的相对长度（T/S=10±2）及总抗氧化能力（0.72±0.18）较A组（T/S=135±5，1）显著降低（P<0.05）。在相同条件的过氧化氢刺激后，B组终板软骨细胞的Ⅱ型胶原（0.60±0.16）、蛋白聚糖（0.75±0.22）表达明显低于A组细胞（P<0.05），而凋亡率显著高于A组细胞（P<0.05）。结论：不同年龄大鼠终板软骨细胞衰老及抗氧化能力存在差异，衰老越明显的终板软骨细胞，总抗氧化能力越低，抵抗过氧化损伤的能力越差。

【关键词】

终板软骨细胞；总抗氧化能力；衰老；凋亡

脊柱退变性疾病已成为世界性的难题[1]，是成人腰痛[2]及颈肩痛[3]的主要原因之一，给个人及社会带来严重的经济负担[1、4]。椎间盘的结构及营养供应具有特殊性[5]，是人体最大的无血管组织，血运少承压重，较易发生退变。终板软骨的退变是椎间盘退变的重要因素[6]。目前对于终板软骨在椎间盘退变中的作用引起广泛关注[7]，但其机制还有待进一步研究。在不同年龄阶段，终板软骨的形态及功能各有差异[8]，已有研究表明氧化应激在终板软骨退变损伤中起到重要作用[9]，但对不同年龄阶段终板软骨细胞抗氧化能力的变化未见报道。因此，本实验拟研究不同年龄阶段的终板软骨细胞在衰老、总抗氧化能力及抵抗过氧化损伤等方面的差异，从氧化应激角度阐释终板软骨细胞的衰老及抗炎化能力变化对椎间盘退变的影响。

1材料与实验方法

1.1实验动物雄性SD大鼠：2月龄，18月龄，由第二军医大学动物中心提供，动物在SPF级饲养室喂养，其温度为22±1℃，光照12h/d，实验动物经过第二军医大学伦理委员会批准。

1.2终板软骨细胞的分离培养参照已有的原代终板软骨细胞提取方法[10]：取目标年龄阶段雄性SD大鼠各3只，处死后无菌条件下取出胸腰段脊柱，切除其附着韧带及结缔组织。显微镜下分离终板软骨，剪碎后用0.3%Ⅱ型胶原酶37℃消化45min，然后加入5倍于胶原酶的血清中和后1000rpm离心5min，重悬后经200目滤网过滤，接种于T75培养瓶内。每隔3d换一次培养液，每隔7d进行传代。本实验中所使用软骨细胞均为第三代细胞，使用前经蛋白聚糖及Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行鉴定。

1.3不同年龄阶段终板软骨细胞的鉴定细胞分为A、B两组，A组为2月龄大鼠终板软骨细胞，B组为18月龄大鼠终板软骨细胞，所有细胞培养至第3代接种于6孔板内，调整细胞密度为每孔1×105个，待贴壁完全后，进行β-半乳糖苷酶染色，并收集细胞提取总RNA，按照PCR的操作步骤检测检测细胞的端粒酶长度。端粒酶相对长度检测方法参照已有文献[11]，β-半乳糖苷酶（碧云天）染色检测细胞衰老情况，严格按照产品说明书进行操作。

1.4不同年龄阶段终板软骨细胞所分泌的蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的比较分别收集第三代A组和B组细胞，提取总RNA，按照已有文献方法PCR检测细胞中蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的含量。将第三代第三代A组和B组细胞以1×105个每孔接种于6孔板内，待贴壁后无血清条件下以浓度为200μmol/L过氧化氢处理2.5h，收集刺激后的细胞按照上述方法PCR检测刺激后蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的含量的变化。Ⅱ型胶原（201bp）：上游序列：TGTTGACATTGCAC-CCATGG；下游引物序列为：CAGCCATTCAGT-GCAGATCC；蛋白聚糖（114bp）上游序列：CT-GTCTATCTGCACGCCAAC；下游引物序列为：GATGTCCTCTTCACCACCCA。

1.5不同年龄阶段终板软骨细胞总抗氧化能力及凋亡情况取第三代终板软骨细胞，以0.25%胰酶消化，中和，离心重悬后，调整细胞密度1×105个每孔接种于6孔板内，待其贴壁后，以总抗氧化能力试剂盒检测试剂盒（碧云天）检测不同年龄来源的终板软骨细胞抗氧化能力的差异。按照上述方法接种细胞于6孔板中，贴壁后无血清条件下以浓度为200μmol/L过氧化氢进行2.5h处理，收集细胞，严格按流式凋亡检测试剂盒说明书通过流式细胞仪检测两种细胞凋亡情况。另外收集处理前后的细胞，提取总RNA，按照PCR检测方法检测凋亡基因caspase-3和Bcl-2在处理前后的表达情况，引物设计及实验方法同前。1.6统计方法用SPSS21.0软件进行统计学分析处理，数据用x±s表示，两组间均数比较采用t检验，P<0.05差异有统计学意义。

2结果

2.1终板软骨细胞的分离培养与鉴定分离培养得到的第三代终板软骨细胞，经蛋白聚糖和Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定，可见绝大部分细胞染色阳性（图1），证明分离所得到的细胞经三代培养后绝大多数为表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的终板软骨细胞。

2.2不同年龄阶段终板软骨细胞鉴定通过β-半乳糖苷酶染色，衰老细胞可被染成绿色。染色结果表明：不同年龄大鼠来源的终板软骨细胞均有不同程度的衰老，但B组细胞排列较乱，细胞尾端分叉较多，被染成绿色的比例较高，衰老较为严重（图2）。细胞端粒酶相对长度的检测也表明B组细胞组端粒酶相对长度（10±2）明显短于A组135±5，差异具有统计学意义（P=0.0356）。

2.3不同年龄阶段终板软骨细胞所分泌的蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的比较RT-PCR检测显示：两种细胞所分泌的蛋白聚糖及Ⅱ型胶原在刺激前后分泌量有所不同。刺激前两组间蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达无明显差异（P=0.0925，0.0915），刺激后B组所分泌的蛋白聚糖及Ⅱ型胶原明显减少，两组间差异显著（P=0.0356，0.0248，表2）。

2.4不同年龄阶段终板软骨细胞总抗氧化能力的比较试剂盒检测显示两种细胞总抗氧化能力差异明显（P=0.0328），即B组细胞的总抗氧化能力（0.72±0.18）较A组细胞（1）低。

2.5不同年龄阶段终板软骨细胞凋亡的比较经相同剂量过氧化氢刺激后，B组细胞的caspase-3及bcl-2表达量较高（P=0.0285，0.0428），凋亡率较高（P<0.05）（表3、4）。

3讨论

终板软骨是一种没有血管分[8]布的，其主要成分包括蛋白多糖、胶原、和水等[12]的结构。椎间盘的营养物质代谢是通过渗透作用实现的[13]，随着年龄的增长，椎间盘的结构及功能发生改变[14]。水分及蛋白多糖减少，其根本原因是细胞外基质合成酶减少，降解因素如凝血酶-4。、ADAMTS-5、基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）分泌增多[15]。正是由于随着年龄的变化，椎间盘合成与分解代谢不同，所具有的生理功能也有所不同，这就是这篇文章研究的理论依据。在很多种疾病如心血管类，牙科类等疾病的发生发展中抗氧化能力起到重要的作用[16]。虽然活性氧簇（ROS）在信号转导和抗菌方面起着重要的作用[17]。但它对很多细胞也有杀伤作用[18]。生理条件下，在抗氧化系统的作用下，ROS维持动态平衡，但在病理条件下，会使其失去平衡。随着年龄的增长，终板软骨抗氧化能力也随之变化。

本实验结果显示两种不同年龄来源终板软骨组织所提取的细胞有所不同。首先在细胞状态上来讲，2月龄的细胞细胞生长速度更快，传代时间更短，光镜下，细胞形态佳，分支少，活性强。且经β-半乳糖脱氢酶染色，显示大龄鼠来源的终板软骨细胞阳性率更高，衰老更明显。且经PCR检测端粒酶相对长度，大龄鼠来源的细胞端粒酶长度相对更短，同生理状况的衰老相一致，可以一定程度上反应体内终板软骨的情况。然而，PCR检测未刺激前不同年龄的终板软骨细胞的蛋白聚糖和二型胶原的mRNA含量没有明显的差异，其可能的原因是，体外的特殊环境将终板软骨细胞功能分泌的蛋白的表达差异弱化，其表达多有所弱化。因此，采用不同年龄终板组织来源的终板软骨细胞可以较准确地对来自不同年龄阶段的终板终板组织的差异性进行评估[19]。

而对不同年龄阶段所取得的终板软骨细胞经相同浓度的过氧化氢处理后，通过PCR检测得到18月来源的终板软骨细胞的二型胶原、蛋白聚糖含量明显减少，与2个月来源的终板软骨细胞具有统计学意义；其可能原因是氧化应激通过盘状结构域受体（discoidindomainreceptors，DDRs）通路氧化应激产生单链DNA损伤信号激活共济失调毛细血管扩张突变（ataxiatelangiectasiamutated，ATM）激酶活性促进受损DNA附近组蛋白磷酸化，上调p53/p21的活性，引发细胞衰老[20]，氧化应激可以上调caspase-3、caspase-7，下调bcl-2[21]，还可以破坏DNA双螺旋结构[22]，导致软骨退变，从而细胞分泌功能降低。18月来源的终板软骨细胞的bcl-2、caspase-3含量明显增加，与2个月来源的终板软骨细胞具有统计学意义。其可能原因氧化应激通过使终板软骨细胞细胞膜发生脂质过氧化，引起细胞膜通透性增加，细胞水肿，从而造成细胞凋亡。通过检测细胞刺激前后细胞功能、细胞凋亡的差异，进而反应不同年龄的来源的细胞抗氧化能力的不同。

衰老指标的评价中，体外培养不同年龄来源的终板软骨细胞β-半乳糖脱氢酶染色上有所差异，但量化较难，但PCR端粒酶相对长度检测可见显著。两种检测方法都说明了不同年龄来源的细胞衰老的不同。β-半乳糖脱氢酶染色，原理在于损伤DNA的测定，而端粒酶相对长度，评价的是染色体端粒酶长度。在客观上，DNA损伤受到多种因素影响，而端粒酶相对长度较为稳定。原代所提取细胞，均为相对活性较高，分裂能力较强者。体外培养，所使用条件相对优越，因此在以DNA损伤为指标的β-半乳糖脱氢酶染色中，差异可能并不明显，染色的差异变现说明问题能力较弱。因此，从年龄越大的个体中取得的原代细胞，不一定必然伴随DNA损伤的显著增加，这可能是由于P38等DNA修复[23]及抗凋亡基因上调[24]等保护因素有关。年老细胞对氧化应激抵抗能力降低的原因可能是由于相关基因GPR48（G蛋白偶联受体48）表达降低[25]，保护性蛋白（泛素化蛋白）产生减少[26]，造成的氧化应激及抗氧化缓冲体系功能降低，在总抗氧化能力指标上，具有明显差异。同时凋亡同退变关系密切。脊椎退行性病变可引起软骨下骨髓血管的分布减少，管腔变细，导致椎间盘内营养的减少及代谢物的淤积，使椎间盘内的PH值、氧分压、渗透压等微环境异常变化，导致终板软骨细胞的凋亡[27]。椎体终板软骨的凋亡可引起椎间盘供养障碍而诱发和加速椎间盘退变[28]。因此，普遍存在的氧化应激刺激，对衰老细胞带来的高凋亡现象，在退变性疾病中可能扮演着重要作用本次实验比较了来自不同年龄阶段大鼠来源的终板软骨细胞抗氧化能力的差异，证明了年老大鼠所获得的细胞中端粒酶相对长度较短，在体外相同培养条件下，对过氧化氢损伤的抵抗能力较低，刺激后凋亡情况更严重。细胞实验因其可操控性强，可有效的控制混杂因素，能够明确各因素间的关系。但因不能完全模拟体内微环境，故最终需要回归大体进行评价，需进一步研究予以明确。总之，基于以上细胞实验，可以明确的是：随着年龄的增加，细胞对于氧化应激损伤的抵抗能力降低，细胞受到氧化应激刺激后更易发生凋亡。这一现象，或对解释衰老在相关退变性疾病中的作用具有一定意义。

作者：黄晓东 叶晓健 王洋 王伟恒 徐立璋 马俊 邓国英 单位：第二军医大学附属长征医院脊柱外科