人结肠癌细胞恶性表型的影响范文

《医学研究生学报》2014年第六期

1材料与方法

1．1细胞转染体系建立及实验分组HT-29和HCT-116细胞株转染方法按Lipofectamine2000产品说明书进行。转染前1d将细胞分别以1×105个/孔、5×104个/孔的密度接种于24孔板中，使转染前细胞融合率达到60%～70%。转染时设定脂质体的浓度分别为0．5、1、1．5μL，并将其稀释于RPMI1640或DMEM培养基50μL，pGPH-shFoxM1及其阴性对照pGPH-shNC的浓度分别为:0．5、1、2、4μg，稀释后脂质体静置5min，与同样用培养基50μL稀释的质粒混合，静置20min，分别加入24孔板中。转染6h后更换新鲜培养液继续培养，48～72h后荧光显微镜观察转染效率。HCT-116、HT-292种细胞株均分为3组，具体如下述:①空白对照组(不转染组);②实验对照组:转染相应空载质粒(pGPH-shNC及pEX-2-NC);③实验组:转染FoxM1干扰质粒及FoxM1过表达质粒。

1．2荧光实时定量(realtimePCR，RT-PCR)法检测FoxM1基因表达水平取各组转染后24h细胞，采用Trizol提取总RNA，经Dnase酶消化基因组DNA后，采用TAKARA公司的反转录试剂盒(Prime-Script1stStrandcDNASynthesisKit)进行cDNA的反转录，方法参照试剂盒说明书。同时采用TAKARA公司的定量试剂盒(SYBRPremixExTaq)进行RT-PCR检测，反应体系参考试剂盒说明书。PCR反应条件为95℃，10s;60℃，10s;72℃，10s;共40个循环。读取CT值，采用△△CT法进行数据分析。FoxM1的定量引物为:正义链:5''''-AACCGCTACT-TGACATTGG-3''''，反义链:5''''-GCAGTGGCTTCATCTTCC-3''''。GAPDH的定量引物为:正义链:5''''-TGTTGCCAT-CAATGACCCCTT-3''''，反义链:5''''-CTCCACGACGTACT-CAGCG-3''''。

1．3Westernblot方法检测FoxM1蛋白表达水平提取转染72h后各组细胞的总蛋白，并进行蛋白定量，按《分子克隆实验指南》［11］所述方法配制SDS-PAGE分离胶(12%)和浓缩胶(5%)，待胶凝固后每孔上样30μg蛋白，常规电泳、转PVDF膜、显像。利用图像分析仪对胶片显像条带进行灰度分析，以内参照β-actin进行校正。

1．4划痕愈合试验取对数生长期稳定的转染细胞，细胞接种于包被CollagenⅣ的6孔板，置37℃细胞培养箱中孵育过夜后回收CollagenⅣ，再将培养板在培养箱中干燥过夜，培养至细胞呈现出单层贴壁生长状态。分别在各组单细胞层上划痕，用含10%FBS的培养基继续培养以使划痕愈合。分别于划痕后0、12、24、48h每个孔取4个视野拍照，在倒置显微镜下观察划痕愈合能力，用愈合率代表愈合能力。

1．5Transwell侵袭试验取对数生长期稳定转染细胞，用无血清RPMll640培养过夜。通过24孔趋化小室和matrigel胶检测细胞侵袭性。结果表示为穿过matrigel胶和聚碳酸酯膜的细胞数，显微镜下每个复孔取5个高倍镜视野计数(×400)，计算平均值。

1．6统计学分析采用SPSS17．0软件进行统计分析。定量结果以均数±标准差(x±s)表示，两组间均值比较采用t检验，多组之间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)。以P≤0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．12株人肠癌细胞系的FoxM1表达分析RT-PCR及Westernblot检测均显示，FoxM1在HT-29细胞中表达水平较HCT-116高。见图1。

2．2HT-29和HCT-116转染体系的建立采用pGPH-shNC(FAM)空载体转染HT-29和HCT-116细胞48h后检测荧光信号，根据荧光强度检测转染效率，从而建立高效的HT-29和HCT-116转染体系。结果表明，脂质体为1μL/孔，pGPH-shNC(FAM)浓度2μg/孔时，共培养48h为最佳的转染条件。见图2。

2．3FoxM1基因对HT-29和HCT-116侵袭性的影响为研究FoxM1的表达对人结肠癌细胞的调控，本研究基于优化的HT-29和HCT-116转染体系，应用RNA干扰技术有效下调FoxM1在HT-29细胞中的表达，同时采用过表达质粒调高HCT-116中FoxM1表达水平，24h后提取RNA，72h后提取蛋白。RT-PCR检测结果表明HCT-116细胞株中过表达FoxM1后其mRNA的表达水平显著上调，采用pGPH-shFoxM1转染HT-29细胞后，FoxM1表达水平显著下调。Westernblot结果亦表明，FoxM1蛋白在HT-29中成功下调，在HCT-116中成功上调。见图3。

2．3．1划痕愈合实验转染pGPH-shFoxM148h后，HT-29的增殖能力明显受到抑制，愈合率仅为(10．37±3．86)%，与HT-29实验对照组(42．0±2．0)%及HT-29空白对照组(37．0±2．2)%相比差异具有统计学意义(P＜0．05)。而在HCT-116细胞中上调表达FOXM1后，愈合率提高至(70．92±1．48)%，表示增殖力明显得到了提高，与HCT-116实验对照组［(18．43±3．01)%］及HCT-116空白对照组［(67．36±2．61)%］相比差异具有统计学意义(P＜0．05)。见图4。

2．3．2Tanswell小室检测细胞侵袭能力HT-29和HCT-116肠癌细胞接种在Matrigel胶铺被的transwell小室中48h之后，HCT-116实验组平均穿膜细胞数［(186．0±6．8)个］较HCT-116实验对照组［(42．0±2．0)个］和HCT-116空白对照组［(37．0±2．2)个］升高，差异有统计学意义(P＜0．05);HT-29实验组平均穿膜细胞数［(53．0±1．8)个］较HT-29空白对照组［(118．0±4．0)个］和HT-29实验对照组［(95．0±2．2)个］降低，差异有统计学意义(P＜0．05)。见图5。

3讨论

FoxM1参与细胞增殖、凋亡以及人体多种器官发育［4］。FoxM1仅表达于高增殖状态的细胞中，如所有胚胎组织，特别是上皮和间质的增殖细胞中;在人体组织中，FoxM1仅高度表达于胸腺和睾丸组织，中度表达于肺和肠道［12］。恶性肿瘤的发生正是由于在致癌因素作用下，遗传物质发生改变导致细胞增殖信号过度活化。研究发现，FoxM1常高表达于肝癌［13］、前列腺癌、胃癌［15］等多种恶性肿瘤中，同时，它与多种癌基因信号转导途径相关［16］，包括表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)信号通路、磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3kinese/proteinkinaseB，PI3K/Akt)信号通路、核转录因子κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)信号通路、细胞外信号激酶(extracellularsig-nal-regulatedkinase，ERK)信号通路、蛋白酶体通路等。特异性FoxM1抑制剂在肿瘤治疗方面的研究提示FoxM1极有希望成为一个新的抗癌靶点。在肝细胞癌(hepaticcellulercancer，HCC)中，FoxM1是ERK的主要效应器。FoxM1b在HCC小鼠模型及HCC细胞系中，均有高表达。其表达增高与ERK正相关，可促进HCC的肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞凋亡。相反，抑制FoxM1b表达，可下调ERK激活水平，减少HCC细胞株的血管形成，促进细胞凋亡。FoxM1c可增强细胞增殖的关键因子cyclinE/Cdk2的表达，后者被认为是c-myc基因的反式激活启动子［4］。有学者在胃癌细胞株研究中发现，c-myc是FoxM1调控的下游基因。国内外研究发现，FoxM1和NF-κB在细胞分化、细胞周期、细胞增殖、细胞死亡、细胞迁移等生物学行为中发挥重要作用，但两者之间的相互作用机制仍需进一步阐明。Ma等发现，Raf/MEK/MAPK的激活对于FoxM1核转移不可或缺，同时，可促进FoxM1与cyclinB1之间交互作用，继而促进细胞的有丝分裂。应用Raf/MEK/MAPK抑制剂U0126后，FoxM1表达显著受抑，并使细胞停滞于G2/M期。综上所述，FoxM1表达失调与多种细胞增殖、凋亡等进程相关细胞因子及信号转导通路均相关，已成为研究肿瘤发生、发展过程中的新热点分子。

本研究在细胞水平探索了FoxM1表达水平变化对结肠癌细胞的体外运动和侵袭性。首先针对FoxM1基因设计了3条不同的siRNA干涉序列，优化siRNA转染条件后应用不同的siRNA对细胞进行转染，最终选定抑制效果最强的FoxM1siRNA。继而根据该序列合成干扰表达质粒pGPH-shFoxM1。应用RT-PCR及Westernblot检测，提示FoxM1在HT-29细胞中高表达，而在HCT-116细胞中呈低表达。进一步在细胞水平探索了FoxM1表达对结肠癌细胞的体外运动和侵袭性的影响。采用RNA干扰的方法下调结肠癌细胞HT-29中FoxM1表达水平并采用过表达质粒调高HCT-116中FoxM1表达，利用划痕实验和细胞侵袭实验探讨FoxM1对结肠癌细胞生长和侵袭能力的影响。结果显示RNA干扰可使FoxM1表达下调，下调FoxM1表达可抑制细胞的迁移能力和侵袭性。反之，过表达质粒可有效调高FoxM1表达水平，上调FoxM1表达可提高细胞的迁移能力和侵袭性。本研究与Kalinichenko等研究结果相似，抑制FoxM1表达可显著抑制肝癌等多种细胞的迁移能力和增殖性。这些结果均为寻找新的治疗靶点提供了有力的依据。总之，FoxM1对结肠癌细胞增殖和侵袭能力具有重要的影响，具有发展成新型结肠癌治疗靶位的潜力。

作者：冒晓蓓刘小北徐凯褚晓源郁红菊薛利军陈亚楠任丽丽戴婷婷陈龙邦单位：第二军医大学南京临床医学院