药用辅料橄榄油中甾醇谱的研究范文

《药物分析杂志》2015年第十一期

油脂类辅料作为一类源于食品工业(通常被认为是安全的:美国FDA列入GRAS)应用于制药中已经有相当长的时间，大多应用于生产注射剂、乳剂、润滑剂、营养剂等的药用辅料。常用的油脂类辅料植物油有橄榄油、大豆油、杏仁油、花生油、玉米油、椰子油等。植物油中含有比较丰富的植物甾醇，不同的植物油中甾醇组成差异较大，故甾醇组成及含量在植物油的评价中发挥着重要作用。目前药用辅料植物油的国家标准中，并不包括甾醇组成的检查。测定植物甾醇的方法有很多。早期的方法［1］有毛地黄皂甙沉淀法、Liebermann－Burhcard可见光比色法、酶法等，但是这些方法干扰因素较多，且只能测定甾醇总含量，不能对各甾醇组成进行分离鉴别。后有文献报道利用薄层色谱法(TLC)［2］分离和分析植物甾醇和植物甾醇酯，根据斑点的大小和颜色的深浅虽然可判断各甾醇组分的大致比例，但该方法灵敏度和定量准确度较低。目前研究最多的方法是高效液相色谱(HPLC)［3］、衍生化处理－气相色谱(GC)［4］和气相色谱法－质谱联用(GC－MS)等现代色谱分析方法，这些方法不仅能测定植物甾醇的总量，还能够分别定量检测出各甾醇组分的含量。本研究选用橄榄油作为研究对象，将高效液相色谱法和衍生化处理－气相色谱法联合运用，分析橄榄油中的甾醇组成及百分含量。

1仪器与试药

1.1仪器美国Agilent公司1200/1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司7890型气相色谱仪;CARBOLITE电热恒温干燥箱，上海一恒科技有限公司DZF－6030A型真空干燥箱。

1.2试药乙醇、石油醚(40～50℃)、丙酮、吡啶等试剂为分析纯，异丙醇、正己烷为色谱纯，水为超纯水。橄榄油(共3批，1个企业)，葵花籽油对照(批号MKBK1503V，Sigma)，胆甾醇对照品(批号111618－200301，中国食品药品检定研究院)、β－谷甾醇对照品(批号110851－201407，中国食品药品检定研究院)。

2实验方法

2.1样品处理精密称定橄榄油、葵花籽油各5.0g，置250mL锥形瓶中，加氢氧化钾乙醇溶液50mL，加热回流1h进行皂化。冷却后移至分液漏斗中，用石油醚(40～50℃)萃取3次，每次50mL，合并石油醚提取液，置另一个分液漏斗中，用50%乙醇溶液洗涤3次，每次50mL，弃去水层，水浴去石油醚，所得残渣在105℃干燥至恒重，计算不皂化物的含量，不皂化物结果见表1。取所得样品的全部不皂化物，用石油醚(40～50℃)溶解3次至试管中，每次4mL，氮气吹干，加流动相适量(约1mL)溶解残渣，经0.45μm滤膜滤过，作为供试品溶液，用于色谱分离分析。

2.2液相色谱分析采用Kromasil60－5SIL硅胶柱(250mm×4.6mm，5μm)，以异丙醇－正己烷(1∶99，v/v)为流动相等度洗脱，流速1.0mL•min－1，检测波长210nm，进样量20μL。对照品及样品的典型色谱图见图1。以胆甾醇的出峰时间为参考，收集从20min至32min的洗脱液，为提高浓度，以2次或3次液相色谱进样所得的洗脱液吹干后为1个供气相分析样品。提取的不皂化物组成比较复杂，液相色谱分离有很多杂质，不采用同填料预柱(即硅胶)时，色谱柱进样多次后有很多杂质强保留在柱子中，继续进样供试品溶液的保留时间不断前移使甾醇不能与其他物质分离，因此最好使用相同填料预柱对供试品溶液在进入色谱柱前进行过滤。

2.3气相色谱分析衍生化溶液的制备:取“液相色谱分析”项下供试品溶液洗脱收集后的残渣，加无水吡啶0.2mL，加N，O－双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA)－三甲基氯硅烷(TMCS)(99∶1，v/v)0.2mL，密封，混匀，80℃加热20min，取出，放冷，取液体层，即得供试品衍生化溶液。分别取对照品溶液、胆甾醇液相色谱洗脱收集后的残渣，自“加无水吡啶0.2mL”起同法操作，取液体层作为对照品衍生化溶液、胆甾醇衍生化溶液。色谱柱:DB－5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm);进样口温度:290℃;进样量:2～3μL;分流比为25∶1;载气:氦气;流速1.8mL•min－1;程序升温:起始柱温260℃，保持50min，再以5℃•min－1的速率升温至290℃，保持5min。取对照品衍生化溶液、胆甾醇衍生化溶液与衍生化供试品溶液2～3μL，注入气相色谱仪，记录色谱图，葵花籽油作系统适用性试验，葵花籽油的甾醇色谱图中菜油甾醇峰与豆甾醇峰的分离度大于4.0。本实验中，葵花籽油的甾醇色谱图中菜油甾醇峰与豆甾醇峰的分离度为4.43。按表2所附的相对β－谷甾醇峰的保留时间［7］鉴别各甾醇峰，各甾醇峰相对β－谷甾醇峰的保留时间见表2。空白色谱图(A)、葵花籽油典型色谱图(B)以及橄榄油典型色谱图(C)见图2。根据所得气相色谱图，计算从胆甾醇到△7－燕麦甾醇15个峰的总峰面积，按面积归一化法计算各甾醇的相对含量，3批橄榄油的甾醇组成及含量见表3。测得橄榄油中含有多种甾醇，其中β－谷甾醇的含量比较高，占总甾醇量的80%以上，其次是菜油甾醇，△5，24－豆甾二烯醇，未检测出24－亚甲基胆甾醇、菜油甾烷醇、△7－燕麦甾醇、桦木醇。

3讨论

本研究所采用的实验方法，首先从橄榄油中提取不皂化物，运用高效液相色谱法从不皂化物中分离并收集甾醇的馏分，进一步提纯，使得纯度和分离度更高，然后加入硅烷化试剂对馏分进行衍生化，并采用气相色谱法检测各甾醇的组成及百分含量，是一种测定植物油中甾醇组成及百分含量的较好的方法。目前，像橄榄油这类具有极佳的营养保健功效、且价格昂贵的植物油，掺假现象屡屡发生，所以对植物油特别是昂贵的油类如橄榄油的掺假鉴别是非常重要的。在以往的研究中，植物油中脂肪酸的组成可作为掺假鉴别项，但是，随着现代技术的不断提高，使得掺假油中脂肪酸组成和真油中的达到一致已经成为可能，所以只通过分析油脂类样品中的脂肪酸组成以判定是否掺假是远远不够的。而不同植物油中甾醇组成差异较大，而且相同品种中的甾醇组成受环境条件、果实成熟度以及加工工艺的影响比较小，故甾醇组成可以作为多种植物油的指纹图谱［8］。Dulf等［9］采用GC/FID技术分析了菜籽油和橄榄油样品中的甾醇组成，结果显示菜籽油中含有菜子甾醇，而在橄榄油中未检出;β－谷甾醇与菜油甾醇比值在初榨橄榄油中较高，在菜籽油或掺假的橄榄油中比值较低;菜油甾醇与菜子甾醇在菜籽油中比值低而在特级初榨橄榄油中比值高，结合以上3个结果能很好地鉴别特级初榨橄榄油是否添加菜籽油。Grob等、Al－Dabbas等［11］通过在线耦合LC/GC/FID检测分析植物甾醇以鉴定菜籽油、大豆油、葵花籽油对橄榄油的掺假。有文献报道菜籽油含有100～1100mg•kg－1的菜籽甾醇，橄榄油含有683～2610mg•kg－1的β－谷甾醇和34～266mg•kg－1的Δ5－燕麦甾醇，这些明显的差别对品种和掺假的检测提供了有用的信息，因此通过测定甾醇组成及总量，可对橄榄油进行掺假鉴别。本论文的研究也为植物油特别是昂贵的油类如橄榄油的掺假鉴别提供参考，但由于植物油脂的多样性，组成的相似性和复杂性，还需要增加植物油脂品种和批次以及探索更好的数据处理方法，以便进一步深入地研究。

作者：方欣欣 徐明明 郑璐侠 陈妙芬 陈钢 单位：上海市食品药品检验所 上海医药工业研究院