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高尿酸血症对缺血性脑卒中的作用

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摘要:目的:探讨高尿酸血症对缺血性脑卒中的影响。方法:175只Wistar大鼠,分为空白对照组(35只,不做任何处理)和大脑中动脉闭塞(MCAO)组(140只),MCAO组又根据是否给予及给予抗高尿酸药物别嘌呤醇(All)浓度不同分为:MCAO对照组(35只)、MCAO+All(10mg)组(35只)、MCAO+All(20mg)组(35只)和MCAO+All(30mg)组(35只);测定比较各组大鼠血清及脑组织中尿酸、IL-6和TNF-α水平及蛋白表达,以及脑梗死面积。结果:MCAO组血清尿酸水平显著高于空白对照组[(90.38±31.27)mmol/L比(56.26±8.82)mmol/L],P=0.001。与MCAO对照组比较,MCAO+All10mg,20mg和30mg组中血清及脑组织中IL-6[血清:(25.63±0.7)ng/L比(23.52±0.6)ng/L、(18.33±0.9)ng/L、(20.11±0.8)ng/L,脑组织:(1.20±0.32)ng/L比(0.98±0.26)ng/L、(0.64±0.34)ng/L、(0.87±0.16)ng/L]和TNF-α[血清:(200.42±8.2)ng/L比(184.37±6.2)ng/L、(165.75±6.8)ng/L、(171.25±7.5)ng/L,脑组织:(2.41±0.6)ng/L比(2.12±0.2)ng/L、(1.62±0.8)ng/L、(1.77±0.5)ng/L]水平和蛋白表达均明显降低,脑梗死面积[(48.42±6.2)%比(40.25±3.1)%、(10.48±4.2)%、(22.42±5.2)%]均明显缩小;且MCAO+All(20mg)组的血清及脑组织中IL-6和TNF-α水平及蛋白表达最低,脑梗死面积最小(P<0.05或<0.01)。结论:缺血性脑卒中大鼠尿酸水平明显升高,抑制尿酸水平可改善炎症及梗死面积,这可能是通过炎症分子通路对其发挥作用。

关键词:卒中;高尿酸血症;肿瘤坏死因子α

缺血性脑卒中(IschemicStroke,IS)是一种全球范围内的高危促死亡疾病。据统计,在脑卒中疾病诊断中,高达80%的病例属于缺血性脑卒中[1]。该疾病的主要病因是血栓导致脑动脉血管闭塞。脑血管的循环受阻引起氧供量和能量摄取下降,从而导致活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)和促炎症分子表达水平上升而引起梗死[2]。尽管梗死是不可逆脑组织损伤,但科学家发现选择合适的药物和可行性物理治疗方法对缺血性半影区,即围绕在梗塞中心的脑组织区域进行治疗可以缓解缺血性脑卒中症状[3]。再灌注是一种治疗缺血性脑卒中的有效方法,主要依据是血栓溶解药物在重组组织纤维蛋白溶解酶激活剂的作用下能产生静脉溶栓作用,但其受到治疗时间的限制,比如急性缺血性脑卒中发生5h后才能治疗[4]。研究发现,缺血性脑卒中与炎症作用息息相关[5]。缺血性脑卒中产生的坏死细胞和碎片残留会导致大脑免疫细胞小神经胶质细胞激活,从而促进炎症细胞和黏附分子的表达[6]。趋化因子刺激炎症细胞移位至缺血性半影,而炎症细胞产生的白介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α等细胞毒素分子会影响交感神经系统[7]。选择蛋白、整联蛋白和免疫球蛋白等黏附分子促进尿白血球循环并作用缺血性损伤部位[8]。血小板、内表皮细胞、淋巴细胞和白血球等细胞间的相互作用会导致微脉管血栓和免疫细胞渗透至脑薄壁组织[9]。目前,从炎症作用方向研究和探索抗免疫或促免疫作用药物来治疗缺血性脑卒中成为一种潜在可行性方案。高尿酸血症是由于人体内尿酸形成过多或排泄过少而引起的代谢紊乱疾病。在亚洲有43.1%的人患有此病[10]。我国有近10%的人受高尿酸血症的影响,且发病人群还在不断增加[11]。高尿酸血症是很多疾病的风险因子,比如缺血性脑卒中、痛风、高血压、肥胖症和糖尿病等。高尿酸表达会引起促炎症细胞因子的增加,打开核转录因子(NF)-κB信号通路,最后导致下丘脑胶质增生形成血栓。研究表明,在缺血性脑卒中患者中,血清尿酸代谢异常[12]。本实验旨在通过研究高尿酸血症对缺血性脑卒中的影响及分子机制,探讨从免疫方向治疗缺血性脑卒中的潜在意义。

1资料与方法

1.1材料与试剂

ADVIA2400自动生化分析仪购买自西门子公司,IL-6和TNF-α抗体购买自上海银海圣生物科技有限公司。IL-6酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒和TNF-αELISA试剂盒均购买自日本SCETI生物科学出口有限公司,高速冷冻离心机购自Thermo公司,氯化四唑(TTC)染液购买自上海哈灵生物科技有限公司,琼脂糖凝胶试剂和硝酸纤维素膜购买自ThermoFisher公司。

1.2Wistar雄性大鼠的饲养、处理及分组

175只8周龄Wistar雄性大鼠购买自上海中科院动物所。Wistar大鼠饲养在SPF动物房(温度25℃;湿度60%),光照周期12h/12h,自由摄取食物和水。在进行实验模型构建前12h禁食。动物实验依照国家研究所关于实验动物护理和使用健康指导。将Wistar雄性大鼠随机分为5组:空白对照组(n=35),MCAO对照组(n=35),MCAO+All(10mg)组(n=35),MCAO+All(20mg)组(n=35),MCAO+All(30mg)组(n=35)。MCAO模型的构建采用线栓法,鉴定采用BedersonJB5分分级法。对MCAO+All3组大鼠进行别嘌呤醇不同给药浓度(10mg•kg-1•d-1,20mg•kg-1•d-1,30mg•kg-1•d-1,溶于饮用水)处理2周,空白对照组不做任何处理,MCAO组仅采用残栓法构建MCAO模型。

1.3大鼠大脑中动脉闭塞模型构建

用线栓法对Wistar雄性大鼠进行手术构建MCAO模型,手术时灯光照明并酒精灯加热保证大鼠37℃体温。用10%水合氯醛(V/W:0.35ml/100mg)腹腔内注射麻醉大鼠,正中切开颈部并暴露颈总动脉(commoncarotidartery,CCA)、颈内动脉(internalcarotidartery,ICA)和颈外动脉(externalcarotidartery,ECA),对ECA和CCA进行结阻。然后在闭塞ICA(阻止流血)的条件下将消毒尼龙线插入至大脑中动脉阻塞该部位的血液循环形成大脑中动脉闭塞。4h后麻醉大鼠并切断外露尼龙线并进行缝合完成手术。

1.4血清尿酸水平及IL-1β和TNF-α水平检测

实验开始前对大鼠禁食12h,麻醉后快速抽取空白对照组和MCAO对照组心脏血10ml,其他3组各5ml。用ADVIA2400自动生化分析仪测定空白对照组和MCAO对照组血清尿酸(各5ml血样);剩余血样离心收集上液血清保存于-80℃冰箱。用ELISA试剂盒对血清中的IL-6和TNF-α进行检测。具体步骤:将-80℃保存的样品和试剂盒平衡至室温25℃;IL-6和TNF-α抗体分别包被于微板上;分别加入标准品、样品和空白对照;再依次加入辣根过氧化物酶孵育;最后加酶底物显色测450nm光密度OD值。做标准曲线并计算IL-6和TNF-α的含量。

1.5Westernblotting检测IL-6和TNF-α蛋白表达

用断头法处死大鼠并取大脑中段组织2mm,剪碎后用匀浆机进行匀浆处理,往细胞中加入裂解液,20000g4℃离心0.5h得到总蛋白。参照操作说明对样品进行SDS-PAGE电泳、转膜、脱脂、一抗孵育、二抗孵育处理,最后显色并用凝胶成像系统进行蛋白半定量分析。

1.6脑组织TTC染色

采用TTC染色缺血性脑卒中梗塞组织。TTC是一种光敏感脂溶性复合物,活组织或细胞内的脱氢酶可以将其还原为着红色的1,3,5-三苯甲臢(1,3,5-triphenylformazan,TPF),而死组织或细胞则不着色。对再灌注分离得到的脑组织进行-20℃半小时处理,然后切成薄片置于无菌的2mm薄片上,将切片放入0.05%TTC溶液中(TTC/磷酸盐缓冲溶液),37℃孵育半小时,观察并拍照。

1.7统计学方法

采用SPSS17软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差(珚x±s)表示,比较采用t检验,计数资料以百分率表示,比较采用χ2检验。多组数据采用F检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1血清尿酸、IL-6和TNF-α水平

MCAO对照组血清中的尿酸水平明显高于空白对照组(P=0.001)。MCAO对照组血清IL-6和TNF-α水平均明显高于空白对照组(P均<0.01),在血清IL-6和TNF-α水平比较中,MCAO+All(10mg)均显著低于MCAO对照组,MCAO+All(20mg)均显著低于MCAO+All(10mg),但MCAO+All(30mg)均显著高于MCAO+All(20mg),P<0.05或<0.01。

2.2脑组织中IL-6和TNF-α的表达

MCAO对照组、MCAO+All(10mg),MCAO+All(20mg)和MCAO+All(30mg)组脑组织中IL-6和TNF-α蛋白表达水平均明显高于空白对照组;IL-6和TNF-α的表达值比较中,MCAO对照组均高于空白对照组,MCAO+All(10mg)均显著低于MCAO对照组,MCAO+All(20mg)均显著低于MCAO+All(10mg),MCAO+All(30mg)均显著高于MCAO+All(20mg),P<0.05或<0.01。IL-6和TNF-α蛋白表达结果与血清中两者的含量水平检测结果相符。2.3脑组织TTC染色在MCAO对照组中,MCAO+All(10mg),MCAO+All(20mg)和MCAO+All(30mg)组中均发现大脑组织苍白区域,显示TTC(+),而在空白对照组中未有苍白区域显示,结果为TTC(-)。与MCAO对照组比较,MCAO+All(10mg),MCAO+All(20mg)和MCAO+All(30mg)组中苍白区域明显减少;MCAO+All(10mg)较MCAO明显减少;MCAO+All(20mg)较MCAO+All(10mg)明显减少;MCAO+All(30mg)较MCAO+All(20mg)明显增加(P均=0.001)。

3讨论

缺血性脑卒中是一种发生率极高的心脑血管疾病。从心脏和肺运输氧气和营养物质供应大脑的运作并带走二氧化碳和细胞内废物是脑动脉循环的主要工作,而此过程受阻极易快速发生缺血性脑卒中,甚至导致死亡。缺血性脑卒中可由多种疾病引起[13]。动脉粥样硬化和胆固醇持续沉淀会引起该病的发生[14]。颈部或脑部的动脉缩小会导致血细胞形成血结,而血结阻塞动脉形成血栓,或者被脑周围动脉捕获形成栓塞。心脏血结也会引起缺血性脑卒中而导致心脏病和心脏膜瓣异常等心脏问题[15]。缺血性脑卒中会引起患者体内各种生理指标的变化,其中血清尿酸是一个明显的变化因子,且其含量升高[16]。细胞死亡、酒精摄取过量、肾功能受损和利尿剂的使用都会导致血清尿酸含量升高[17]。高血清尿酸是缺血性脑卒中的一个风险因子。本实验中,在缺血性脑卒中患者中检测到高含量的血清尿酸。别嘌呤醇(Allopurinol)是治疗高尿酸血症的有效药物。次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下会形成黄嘌呤,进而生成尿酸。别嘌呤醇通过抑制黄嘌呤氧化酶来抑制尿酸的形成。促炎症细胞因子与尿酸呈正相关,且高血清尿酸会引起炎症[18]。在缺血性脑卒中症中,炎症作用包括四个过程:免疫细胞进入缺血性脑组织;免疫细胞的进入、脑水肿和出血对血脑屏障破坏;白血球损伤缺血性脑组织;巨噬细胞和星形胶质细胞作用[19]。研究发现,炎症的媒介细胞因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和转化生长因子(TGF)-β均有参与炎症作用过程[20],且在缺血性脑卒中患者中IL-1和TNF-α水平明显升高,而IL-6水平呈现不稳定性[21]。本实验结果表明,IL-6和TNF-α水平在大鼠大脑中动脉闭塞模型中均明显升高,且通过对高血清尿酸的抑制治疗,发现IL-6和TNF-α水平均有所下降。综上所述,高尿酸血症对缺血性脑卒中有明显影响作用,其作用机制可能与炎症通路相关。但对高尿酸血症在缺血性脑卒中中起到一个独立的风险因子作用的论断还需要进一步的实验探讨。

参考文献:

[16]谢帆.BMSCs移植对缺血性脑卒中大鼠IL-1β、TNF-a表达的影响[D].衡阳:南华大学,2014.

作者:蒋娟莉

岭南急诊医学杂志责任编辑:张雨    阅读:人次
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