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《国际检验医学杂志》2014年第十二期
1资料与方法
1．1一般资料实验菌株：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌，共14种细菌；白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌，共4种真菌。所有实验菌株均按要求分离纯化，并经西安交通大学医学院第一附属医院检验科微生物实验室VITEKCompact全自动细菌鉴定药敏分析仪鉴定。标本来源：从西安交通大学医学院第一附属医院中心ICU、RCU、肝胆外科、胸外科、肾内科、肿瘤外科等多个科室收集90例临床疑似真菌感染患者的穿刺引流液标本，另采集健康人全血标本2mL，提取人类基因组DNA。
1．2方法
1．2．1标本的采集在严格无菌操作下，用一次性无菌注射器穿刺患部，抽取引流液10mL，将2mL注入EDTA－K2抗凝管，剩余8mL注入血培养瓶中进行培养。静脉穿刺采集健康人外周血2mL，注入EDTA－K2抗凝管。抗凝标本放入4℃冰箱中暂存。
1．2．2标本预处理将抗凝管中的引流液标本颠倒混匀，取1mL放入2mL灭菌EP管中，加入1mL10mmol／LTris－HCl（pH8．0）充分颠倒混匀，14000r／min离心5min，弃上清液，沉淀物于－40℃冷冻保存，以备提取DNA之用。
1．2．3标本中真菌基因组DNA的提取用100μL10mmol／LTris－HCl（pH8．0）缓冲液重悬经预处理的标本，加入20μL溶壁酶（10U／μL），用加样器吸打混匀，37℃水浴30min后应用QIAampBloodDNAMiniKit（QIAGEN，Cat．No．51106）提取，操作步骤按照试剂盒说明书。
1．2．4检测真菌通用引物PCR的特异性实验所用真菌通用引物参照Lott等［8］设计ITS1（F）：3′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－5′；ITS3（F）：3′－GCATCGATGAAGAACGCAGC－5′；ITS4（R）：3′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－5′。25μLPCR反应体系包括：10×Buffer2．5μL，MgCl2（25mmol／L）2．0μL，dNTP（2．5mmol／L）2．0μL，上游引物（5μmol／L）0．5μL，下游引物（5μmol／L）0．5μL，Taq酶（5U／μL）0．15μL，模板DNA2μL，灭菌超纯水15．35μL。PCR反应条件：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃40s，共35个循环；最后延伸72℃7min。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳电压为6V／cm，电泳时间为1h，采用溴化乙锭（EB）染色20min，在凝胶成像分析系统拍照保存。
1．2．5制备梯度菌悬液为了检测真菌通用引物PCR的敏感度，本研究用1麦氏单位（约3×108CFU／mL）的白色念珠菌菌液100μL加入200μL纯水，得到约108CFU／mL的菌液，然后进行1∶10倍比稀释，取107、108、1093个稀释度的菌液涂布沙保罗平板，每个稀释度3个平板，每个平板涂100μL，37℃培养48h后计数菌落，选用3个平板的平均菌落数作为参考菌数。提取真菌DNA、PCR反应体系及条件同上。
1．2．6真菌通用引物PCR产物的测序应用QIAquickPCRPurificationKit纯化PCR产物。20μL测序PCR反应体系包括：灭菌去离子水13．5μL，5×BigDyeSeqBuffer3．5μL，2．5×BigDye1μL，测序引物ITS4（3．2pmol／μL）1μL，纯化的PCR产物1μL。反应条件：预变性96℃1min；变性96℃10s，退火50℃5s，延伸60℃4min，共25个循环。测序产物按EdgeBio试剂盒纯化，然后在PCR仪上变性，条件为：95℃4min，4℃4min。用ABI3500xl基因分析仪进行测序。
1．2．7测序结果的比对登陆http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／blast／Blast．cgi，将测序结果与NCBI核酸数据库进行BLAST比对。
1．3统计学处理应用SPSS17．0进行数据分析，采用配对四格表资料的χ2检验对培养法和测序法的阳性率进行比较，P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1真菌通用引物PCR特异性4种真菌的DNA经引物ITS1／ITS4和ITS3／ITS4扩增后均产生单一条带，经与DNA标记物（100bpDNALadder）比对，产物大小和预期相符，而14种细菌及人类基因组DNA经PCR后无任何条带，见图。
2．2真菌通用引物PCR敏感性引物ITS1／ITS4最低检测限为103CFU／mL，ITS3／ITS4最低检测限为102CFU／mL，见图3～4。
2．3真菌通用引物PCR检测临床标本见图5～6。
2．4测序结果11株PCR阳性临床标本经测序均得到较好的序列，与NCBI核酸数据库进行BLAST比对后均可将病原性真菌鉴定到种的水平。
2．5测序法与培养法检测阳性率比较90例穿刺引流液中，培养法检出4例阳性标本（3例白色念珠菌和1例光滑念珠菌），这4例标本经测序法检测也均为阳性；86例培养法检测的阴性标本中有7例标本为测序法检测阳性（5例白色念珠菌、1例光滑念珠菌、1例热带念珠菌）。测序法阳性率是12．22％（11／90），培养法阳性率是4．44％（4／90），测序法阳性率是培养法的2．75倍，二者差异有统计学意义（χ2＝5．14，P＜0．05）。见表1。
3讨论
真菌感染的发病率逐年增加，尤其对于急性播散性念珠菌感染，早期快速地检测和鉴定对选择抗真菌药物非常重要［4］，而传统培养方法的敏感性低且耗时长，这给检测手段提出了新的要求，因此寻找一种快速的检测和鉴定真菌感染的方法势在必行。测序法以其高敏感性和特异性，而成为一种极具前景的真菌感染检测方法。在病原学诊断中，ITS区被越来越广泛地应用于菌种鉴定［11］。但是，目前并没有一个真正意义上的真菌通用引物。因此，本研究首先验证了所用引物的特异性，结果表明这2对引物可以用于扩增临床上常见的病原真菌，且不会将细菌及人类的DNA扩增出来。为了排除假阳性、最大限度地筛检病原菌，并保证片段长度能够在种的水平对常见真菌进行鉴定，本研究用了2对通用引物，其中ITS3／ITS4的扩增产物包括：5．8SrDNA的3′端、ITS2区、28SrDNA的5′端；ITS1／ITS4的扩增产物包括：18SrDNA的3′端、ITS1区、5．8SrDNA、ITS2区、28SrDNA的5′端。研究结果表明，引物ITS3／ITS4最低检测限为102CFU／mL，引物ITS1／ITS4最低检测限为10CFU／mL，且对同一标本，二者测序比对结果一致。
测序法具有较高的检测敏感性和特异性，可以在少量的临床标本中检测到真菌，并可以将检测时限缩短至6～8h，而临床上传统的真菌培养表型鉴定方法一般需2～3d的时间才能得到结果，且有的真菌难以培养鉴定。另外，表型鉴定方法数据库中的信息也是有限的，而绝大多数真菌的基因已被测序完成，数据库十分完善，为真菌PCR测序鉴定提供了充分的保障。真菌感染主要以念珠菌为主，尤以白色念珠菌所占比例最大。本研究结果表明穿刺引流液感染真菌均为念珠菌，主要以白色念珠菌为主，占72．7％（8／11）。
综上所述，本研究通过应用2对真菌通用引物进行PCR测序来鉴定菌种，摸索出了一套切实可行的方法，较传统的培养方法快速，且特异性和敏感性更高。后期工作可进一步收集其他标本类型并仅采用敏感度更高的ITS3／ITS4作为通用引物进行检测，进一步验证该方法，使之成为一套成熟的、临床实用性强的真菌检测手段。
作者：黄君华张书婉张宁单位：西安医学院医学技术系西安市儿童医院检验科西安交通大学医学院第一附属医院检验科