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大鼠多器官功能障碍模型建立研究范文

时间:2022-11-22 03:14:14

大鼠多器官功能障碍模型建立研究

《福建医药杂志》2016年第5期

摘要:

目的对大鼠多器官功能障碍综合征(MODS)模型建立的方法进行探讨。方法将75只大鼠随机分为4组(正常组15只,大肠杆菌法模型组20只,内毒素试剂法模型组20只,酵母多糖法模型组20只),钳断模型组大鼠左下肢,4h后无菌条件下分别于腹腔注射大肠杆菌、内毒素、酵母多糖,比较各组大鼠造模成功率,记录各模型组所需费用和造模难易度。结果各模型组造模成功大鼠符合MODS实验诊断标准。大肠杆菌组成功率明显高于酵母多糖组(90.0%vs35.0%,P<0.05),与内毒素组比较的差异无统计学意义(90.0%vs60.0%,P>0.05),大肠杆菌法、内毒素试剂法、酵母多糖法造模总费用分别为40.0、123.3、325.7元。酵母多糖造模过程复杂。结论钳断大鼠左下肢联合腹腔注射大肠杆菌造模成功率高、成本低,值得推广。

关键词:

大鼠;多器官功能障碍综合征;建模方法

建立多器官功能障碍综合征(MODS)动物模型是研究MODS临床诊治的基础,国内外学者致力于建立标准化的符合临床要求的MODS动物模型。目前,大鼠MODS造模多采用创伤加内毒素或酵母多糖注射的方式,有造模成功率低、存活时间短、费用高昂、造模复杂等缺点[1]。本文对大鼠MODS模型建立的方法进行改良,旨在建立操作简单、成本低、成功率高,符合MODS实验诊断标准的模型。

1材料与方法

1.1材料:1)动物:成年清洁级SD雄性大鼠75只,体质量180~220g,由福建省医学科学研究所动物室提供,生产许可证号SCXK(沪)2013-0006。大鼠使用动物室提供的标准鼠粮和自来水喂养,实验立项经我院实验动物伦理委员会批准。2)试剂:大肠杆菌菌株(E.coli0127:H6)由福建医科大学惠赠。内毒素(4mg/支,Sigma公司)及酵母多糖(1g/支,Sigma公司)。

1.2动物分组及造模:1)分组:应用计算机将大鼠随机分为4组,对照组(n=15),大肠杆菌法模型组(n=20),内毒素试剂法模型组(n=20),酵母多糖法模型组(n=20)。2)造模方法:同时钳断各模型组大鼠左下肢,4h后各模型组大鼠分别于腹腔注射大肠杆菌菌液、内毒素、酵母多糖,造成感染复合创伤2次打击的MODS大鼠模型。大鼠处死前12h禁食,其他时间均标准喂养。①大肠杆菌法模型组:用分光光度法制备细菌浓度为1×109cfu/mL大肠杆菌菌液体待用,同时钳断大鼠左下肢,使大鼠发生粉碎性骨折合并软组织挫裂伤,4h后在无菌条件下按5mL/kg腹腔注射大肠杆菌菌液。②内毒素组:同时钳断大鼠左下肢,4h后将内毒素(1.25mg/kg)稀释后注射[2],方式同上。③酵母多糖组:同时钳断大鼠左下肢,4h后将酵母多糖0.375g/kg配置成蜡块融化状液体后注射[3],方式同上。

1.3观察指标:

1.3.1实验室指标:大鼠2次打击后48h进行空腹采血,测定各组大鼠Cr、BUN、ALT、AST、PLT等指标。空腹采血后处死大鼠,留取肺肝等标本,经福尔马林固定、脱水、石蜡包埋切片、苏木精染色、伊红染色、树胶封片,光学显微镜观察各组大鼠各脏器病理形态。

1.3.2造模成功标准:依据MODS实验诊断标准,根据MODS临床定义,规定动物致伤24h后出现2个或2个以上功能障碍(或衰竭)者方可诊断MODS。受累器官待查项目中肝功能指标中ALT等≥对照值3倍,肾功能中血Cr等≥对照值3倍,凝血功能中PLT等≤50×109/L,确定模型组大鼠各脏器功能衰竭,支持MODS造模成功[4]。

1.3.3其他指标:记录各组大鼠造模成功率、成活情况及各模型组建立所需费用、造模程序。

1.4统计学分析:应用SPSS19.0统计学软件分析数据。计量资料以x±s表示、采用t检验;计数资料用百分比表示,采用χ2检验,且行Bonferroni较正。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1实验室指标:各组造模成功大鼠的Cr、BUN、ALT、AST、PLT水平改变是对照组的3倍以上(表1)。

2.2病理形态:随机抽取造模成功的模型组大鼠肺和肝脏,光镜下见:部分肺泡隔断裂,肺泡腔消失;气管上皮纤毛脱落,上皮下水肿;肺泡上皮细胞增生,肺间质充血、水肿;血管扩张、充血;终末支气管周围、血管周围和肺泡间隔有大量急慢性炎症细胞浸润(图1);肝细胞浊肿,汇管区见慢性炎症细胞和纤维组织增生,中央静脉周围见少量慢性炎症细胞浸润(图2)。根据上述实验室指标和病理形态的改变,模型组大鼠发生了2个以上的脏器功能障碍及形态损伤,符合胡森等[4]提出的MODS实验诊断标准。

2.3各组大鼠造模成功率及死亡率:大肠杆菌法组造模成功18例(90.0%),死亡1例,1例未见多脏器功能衰竭;内毒素组造模成功12例(60.0%),死亡6例,2例未见多脏器功能衰竭;酵母多糖组造模成功7例(35.0%),死亡3例,10例未见多脏器功能衰竭。大肠杆菌组与内毒素组造模成功率无显著变化(P>0.05),两组成功率均高于酵母多糖组(P<0.05)。

2.4各组造模费用及难易度:1)大肠杆菌法造模操作简单,每只平均费用为40.0元;2)内毒素法造模操作简单,每只平均费用为123.3元;3)酵母多糖法造模成本较高如试剂较贵,每只平均费用为325.7元,操作较困难如酵母多糖配制后呈密度极大的浑浊融化蜡块状液体,注入大鼠腹腔困难。

3讨论

MODS是机体在损伤或感染情况下,引发免疫、炎症反应启动、放大,促炎和抗炎互为因果,形成具有破坏力的免疫状态,进而出现瀑布式的级联反应导致器官损伤。研究MODS的替代模型需具备疾病相同的临床情况。目前,国内外学者都试图建立一种与临床MODS常见诱因基本一致,发病在致伤24h后,有2个以上器官或系统的功能障碍,有足够的发病率和死亡率且价格低廉、制作过程简便的模型[4]。造模方式及存在主要问题如下:1)若动物存活率高、则MODS发生率低;若创伤休克严重,则动物死亡率高。2)成本较高如内毒素等制剂价格昂贵,手术操作难度大。此外,若以外科手段造模,如采用肠系膜上动脉阻断方法复制肠缺血再灌注等方式,操作难度大,MODS发生率低或动物死亡率高[1]。采用钳断模型组大鼠左下肢先造成无菌创伤出血,激活机体免疫反应;4h后在无菌条件下给大鼠腹腔注射大肠杆菌菌液替代内毒素,当机体被大肠杆菌感染后,免疫系统启动特异性识别机制进行防御,侵入的部分细菌死亡、溶解释放内毒素,大肠杆菌内毒素作用于肠黏膜上皮细胞,引起一系列细胞因子释放,破坏机体的防御机制,导致局部大肠杆菌繁殖,感染进展[5],成为第2次打击的触发因子,大鼠表现出强烈的全身炎症反应的临床特征,从而造成创伤复合感染2次打击的MODS大鼠模型。对此,从功能指标和组织细胞形态学指标两个方面判断造模是成功的,符合MODS实验诊断标准[4]。此外,对3个模型组的成功率、实验成本、造模难易度进行比较,也证实了大肠杆菌法造模的成功率高,成本低且操作简单。经复习国内外文献,鲜见有类似的报道。总之,大肠杆菌法造模的成功率高,成本低且操作简单,有助于从事MODS研究者们开展实验研究。钳断大鼠左下肢联合腹腔注射大肠杆菌的方法值得推广。

参考文献:

[1]谭清武,李庆华.多器官功能不全综合征动物模型研究现状[J].中国康复理论与实践,2006,12(11):981-982.

[4]胡森,盛志勇,周宝桐.MODS动物模型研究进展[J].中国危重病急救医学,1999,11(8):504-507.

[5]张玉昆,唐英春,覃德冰.内毒素在大肠杆菌和白色念珠菌混合感染小鼠中的作用[J].中山医科大学学报,2002,23(3):200-203.

作者:魏硕 游哲斌 林春锦 何玲玲 郭太林 林帆 江淑萍 戴木森 单位:福建医科大学省立临床医学院福建省立医院干部特诊一科

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