盐酸氯苯胍在红笛鲷体内的药代动力学范文

《广东海洋大学学报》2016年第5期

摘要：

在水温（28±2）℃、盐度28条件下，将盐酸氯苯胍按30mg/kg的剂量口灌红笛鲷，用HPLC-MS/MS法研究ROBH在红笛鲷体内的药代动力学和残留消除规律。结果显示：单剂量口灌给药后，红笛鲷血浆中ROBH的药时数据符合一级吸收二室模型，药物在血浆中的达峰时间tp为1.79h，血药浓度峰值Cmax为211.38μg/L、药时曲线下面积（AUC0-∞）为5229.16μg/(L•h)和消除半衰期（t1/2β）为46.99h；ROBH在红笛鲷其他组织中分布较广，消除速度较慢。肌肉、肝脏和肾脏的Cmax分别为37.58、863.02、1063.24μg/kg，tp均为1.5h，AUC0-∞分别1017.03、20841.20、30743.04μg/(kg•h)；t1/2β分别为26.35、14.05和24.31h。连续5d口灌给药后，红笛鲷血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的药物消除半衰期t1/2分别为46.14、36.11、28.62、26.92h。以10µg/kg为最高残留限量，肌肉作为食用靶组织，在本试验条件下，建议休药期不少于7d。

关键词：

盐酸氯苯胍；红笛鲷；药代动力学；药物残留；消除

盐酸氯苯胍化学名称1,3-双（对氯苯叉氨基）胍盐酸盐，属胍基衍生物，分子式C15H14Cl3N5，相对分子质量370.67，可影响球虫ATP，干扰蛋白质代谢，是一种抗球虫药，具有广谱、高效、低毒、安全、适口性好等特点，对鸡、兔的急、慢性球虫病有良好疗效。盐酸氯苯胍在水产养殖上主要用于防治鱼类的孢子虫病[1-2]。目前，对盐酸氯苯胍的研究主要集中在残留检测方面，其检测方法主要有高效液相色谱法[3-5]、液质联用法[6-9]等。ROBH在水产动物体内的药代动力学和残留消除研究尚未见报道。本研究以红笛鲷为试验对象，研究ROBH在其体内的药代动力学和残留消除规律，为ROBH在鲷科鱼类养殖中的规范应用提供一定理论依据。

1材料与方法

1.1材料

试验用鱼购自湛江市南三岛张高仪老板鱼排，在广东海洋大学东海岛实验基地暂养1周，经检测确认体内无ROBH残留。挑选健康、规格整齐[体质量（256.35±9.18）g]的鱼进行试验。试剂：ROBH标准品，纯度98.5%，购自美国JK；甲醇、甲酸，色谱级；乙酸、无水硫酸钠等均为分析纯。主要仪器液相色谱-质谱联用仪（配有ESI源），美国ThermoFisher公司

1.2方法

1.2.1ROBH标准溶液配制

用甲醇将ROBH标准品准确配制成1.0mg/mL，再用甲醇稀释100倍，配制成质量浓度10µg/mL的标准储备液，于–4℃冰箱储存备用。准确量取ROBH标准储备液，用体积分数50%的甲醇溶液分别稀释成1、2、5、10、20、50、100、250、500、1000ng/mL等10个质量浓度梯度的标准工作液。

1.2.2色谱条件

色谱条柱：ThermoFisherHypersilGoldC18(150mm×2.1mm，5μm)；进样体积：10µL；柱温：30℃；流动相：A为甲醇，B为5mmol/L乙酸铵（含体积分数0.1%甲酸）；流速：300µL/min。洗脱程序见表1。

1.2.3质谱条件

参照文献[10]稍加修改：喷雾电压4500V，鞘气压力45kPa，辅助气压10kPa，毛细管温度350℃，碰撞压200.0mPa。质谱参数见表2。

1.2.4给药及样品采集

药物代谢组：将红笛鲷（试验前停饲24h）随机分成15个组（分别与采样时间点对应），每组10尾鱼置于一个0.3m3的玻璃桶中，另取鱼数尾作为空白对照组。ROBH按30mg/kg剂量口灌实验鱼，于给药后的0.15、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120h时，每组取鱼5尾，尾静脉采血后快速取其肝脏、肾脏和背部肌肉。每尾鱼血液于肝素钠处理的离心管中，以5000r/min离心8min，取上清液于–20℃冰箱保存。肝脏、肾脏、肌肉分别于无菌离心管中，置–20℃冰箱保存备用。残留消除组：红笛鲷随机分成7组，每组鱼10尾，按30mg/kg剂量连续口灌ROBH5d，分别在最后1次给药后0.5、1、2、3、5、7、10d采样，采样方法同药物代谢组。

1.2.5样品处理

参照文献[8-9]稍加修改：血浆和各组织在室温下自然解冻，取血浆1mL，肌肉、肝2.0g，肾脏0.2g，剪碎，分别于离心管中，依次加入5mL甲醇（含体积分数1％甲酸）、4g无水硫酸钠，涡旋振荡，超声15min，以4000r/min离心10min，吸取上层清液后，残渣重复上述操作1次，合并上清液，在40℃水浴中用氮气吹干。用5.0mL甲醇溶解残渣，涡旋振荡，超声15min，以4000r/min离心10min，上清液用0.22µm微孔滤膜过滤，滤液待上机检测。

1.2.6线性范围和检测极限测定

选质量浓度为1、2、5、10、20、50、100、250、500、1000ng/mL等10个标准工作液，按照1.2.2、1.2.3所确定的实验条件，以峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标进行线性回归。

1.2.7回收率和精密度测定

采用加标回收法，在空白样品（血浆、肌肉、肝脏、肾脏）中分别加入5、50、100ng/mL的ROBH标准溶液，再按1.2.5处理样品，每个浓度做6次平行。

1.2.8数据处理

用Excel2003处理药时数据，模型的拟合和参数推算用DAS3.0软件处理。

2结果

2.1方法验证

2.1.1线性范围和检测极限

ROBH为1~1000ng/mL时，峰面与质量浓度有良好线性关系（图1）。以3倍信噪比计算，检出限为0.001mg/kg。

2.1.2回收率和精密度

表3可见，ROBH在添加水平5、50、100ng/mL时，各组织加标平均回收率为88.85%~116.78%，相对标准偏差为2.96%~9.15%，说明样品处理方法稳定，重现性好，可满足各组织中样品检测要求。

2.2ROBH在红笛鲷各组织中的药–时曲线

红笛鲷按30mg/kg口灌ROBH后，药-时曲线见图2。从图2可见，各组织中的药-时曲线均呈双峰现象，出峰时间血浆中分别为1.5和6h，肌肉中分别为1.5和8h，肝脏中分别为1.5和12h，肾脏中为1.5和8h，药物峰值cmax血浆中分别为235.77和201.51μg/L，肌肉中分别为37.58和33.23μg/kg，肝脏中分别为863.02和702.47μg/kg，肾脏中分别为1063.24和975.48μg/kg。

2.3ROBH在红笛鲷血浆中的药代动力学参数

经DAS3.0软件分析，ROBH血浆的药-时数据符合一级吸收二室模型，理论方程为C=290.17e–0.12t+27.91e–0.02t–318.08e–1.09t，药动学参数见表4。

2.4ROBH在红笛鲷其他组织中的药代动力学参数

推算的ROBH在红笛鲷体内组织中药动学参数见表5。cmax和AUC0-∞：肾脏＞肝脏＞肌肉；MRT0-∞：肌肉＞肾脏＞肝脏；t1/2：肌肉＞肾脏＞肝脏。说明ROBH主要分布于肾脏和肝脏，在肌肉中平均驻留时间最长，消除半衰期明显高于肾脏和肝脏。

2.5ROBH在红笛鲷体内的消除

连续口灌5d的药物消除曲线见图3，曲线方程及相关参数见表6。图3和表6可见，ROBH残留量在肌肉中最低，肾脏中最高。t1/2：肌肉＞肝脏＞肾脏＞血浆，说明ROBH在红笛鲷肌肉中消除最慢。

3讨论

3.1ROBH在红笛鲷组织中的药–时曲线特征

红笛鲷以30mg/kg单剂量口灌ROBH后，血浆和组织中的药时曲线均出现明显的双峰现象。目前，关于口服药物c–t曲线的双峰现象报道较多，认为引起该现象的主要原因是肝肠循环和非齐性吸收，两峰相隔时间2~20h[11-13]。药物进入十二指肠后，可在小肠重吸收返回肝脏，形成肝肠循环，引起双峰现象。口服药物进入体内时，需经过胃肠道上、下两个部位吸收，由于胃肠道的不同部位和管壁对药物的通透性不同，也可导致双峰现象[14]。此外，还可能与药物的分布、重吸收有关，即当其他组织的药物浓度高于血浆时，药物可能转移至血浆而引起血浆的另一个高峰[15]。由图2可见，ROBH在吸收阶段，肝脏和肾脏中的药浓度明显高于血浆，此时肝脏和肾脏中的ROBH可能转移至血浆中，再随血液分布于其他组织中而产生第2个浓度峰。

3.2ROBH在红笛鲷体内的药代动力学特征

ROBH为驱虫渔药，目前尚未见ROBH在水产动物体内药代动力学的研究报道。本研究在水温（28±2）℃、盐度28条件下，将ROBH按30mg/kg的剂量口灌红笛鲷后，红笛鲷血浆中的药时数据符合一级吸收二室模型，其血浆、肌肉、肝脏、肾脏中的药物浓度均在1.5h左右出现第1次峰值，cmax分别为211.3800µg/L、37.58µg/kg、863.02µg/kg、1063.24µg/kg，AUC0-∞分别为：5229.16µg/(L•h)、1017.03µg/(kg•h)、20841.20µg/(kg•h)、30743.04µg/(kg•h)，说明ROBH口灌给药时在红笛鲷体内吸收较为缓慢，药物多分布于肝脏和肾脏，血浆和肌肉中分布较少，大部分药物经肝脏和肾脏直接排出。t1/2β和MRT0-∞是反映药物在动物体内消除快慢的重要参数。红笛鲷单剂量口灌ROBH后，t1/2β依次为：血浆（46.99h）＞肌肉（26.35h）＞肾脏（24.31h）＞肝脏（14.05h），MRT0-∞依次为：血浆（129.72h）＞肌肉（41.29h）＞肾脏（39.19h）＞肝脏（27.62h），说明ROBH在红笛鲷体内血浆和肌肉中消除较缓慢，驻留时间较长。

3.3连续口灌给药后ROBH在红笛鲷体内的残留消除及休药期

红笛鲷连续5d口灌给药后，组织中的药物残留浓度依次为：肾脏＞血浆＞肝脏＞肌肉，药物t1/2β依次为：肌肉（46.14h）＞肝脏（36.11h）＞肾脏（28.62h）＞血浆（26.92h），表明ROBH在红笛鲷体内消除较为缓慢，肌肉中残留消除最慢。班付国等[16]研究鸡连续饲喂含500mg/kg氯苯胍的饲料7d后停药，在停药后第3天，肌肉组织未检出氯苯胍残留，各种第5天组织的残留量均低于文献[17]的规定，从各组织氯苯胍的残留量来看，在脂肪中的残留量最高，其次为肝脏，肌肉中的残留量最低，表明氯苯胍在鸡体内残留消除较为缓慢。本研究结果与班付国等的研究结果基本一致，但ROBH在红笛鲷体内的消除速度比氯苯胍在鸡体内的消除慢，可能与研究对象对药物的代谢速度不同有关。目前，中国、欧盟及美国等均制订了氯苯胍在动物源食品中的最高残留限量。2002年，我国规定ROBH在鸡脂肪、皮及其他可食用组织中的最高残留限量分别为200、200、100µg/kg[17]。中国和欧盟等对水产品中ROBH暂无明确的残留限量要求。根据日本2006年实施的食品中农业化学品残留“肯定列表制度”，要求对于未制定最大残留限量标准的农业化学品在食品中含量不得超过10µg/kg，对于已建立最高残留限量标准的化学物质则在食品中含量不得超过最高标准[18]。本研究将ROBH的最高残留限量暂定为10µg/kg，以肌肉作为食用靶组织，停药后5d时肌肉中的药物浓度为2.57μg/kg，已低于设定的最大残留限量，鉴于本研究未检测鱼皮中的药物含量，为保证消费者的安全，将休药期适当延长。因此，在本试验条件下，建议ROBH在红笛鲷体内的休药期至少为7d。

参考文献：

[1]吴仕辉,陈昆慈,戴晓欣,等.分散固相萃取/高效液相色谱法测定水产品中氯苯胍的残留量[J].分析测试学报,2011,30(12):1356-1361.

[2]杨先乐,陆承平,战文斌,等.新编渔药手册[M].北京:中国农业出版社,2005:204-241.

[3]李俊玲,刘学江,徐强,等.饲料中盐酸氯苯胍的测定[J].饲料广角,2003(15):20-23.

[4]刘勇军,吴银良,姜艳彬.高效液相色谱法测定鸡组织与鸡蛋中的盐酸氯苯胍的残留量[J].色谱,2010,28(9):905-907.

[5]莫金杰,刘娟,胡玉霞,等.HPLC法测定盐酸氯苯胍原粉含量[J].畜牧市场,2011(2):19-20.

[13]黄月雄,汤菊芬,简纪常,等.氟苯尼考在美国红鱼体内的药代动力学和组织分布[J].广东海洋大学学报,2014,34(3):58-64.

[15]王贤玉,宋洁,王伟利,等.氧氟沙星在吉富罗非鱼体内的药代动力学及残留的研究[J].大连海洋大学学报,2011,26(2):144-148.

[16]班付国,吴宁鹏,李慧素,等.氯苯胍在鸡组织中的残留消除规律研究[J].中国兽药杂志,2012,46(11):24-26.

[17]农业部235号公告．动物性食品中兽药最高残留限量[R],2002．

[18]吴晓峰,沈毅诚,孙蓓玲.日本“肯定列表制度”我国出口水产品面临的严峻挑战[J].中国动物检疫,2006,23(6):49-50.

作者:汤菊芬 蔡佳 黄瑜 廖建萌 黄月雄 简纪常 单位:广东海洋大学水产学院 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 湛江市食品药品检测所