灰树花菌丝体生长分析范文

《食用菌学报》2016年第1期

摘要：

考察添加不同浓度的氧化铝（粒径为200～300目）对灰树花发酵菌丝体生长及多糖（胞内和胞外粗多糖）产量的影响。结果表明，在试验添加范围内，灰树花菌球直径随氧化铝添加浓度的增加而显著变小，当添加氧化铝浓度为20g／L时，游离菌丝体明显增多，且菌球主要表现为S型（D＜0．5cm，D：菌体当量直径，与对象具有相等面积的圆形的直径），其中L（D≥1．5cm）、M（0．5cm≤D＜1．5cm）和S型菌丝体的比例分别为4．9％、24．3％和70．8％；添加3g／L氧化铝时灰树花菌丝体生物量最高，达到5．81g／L，比空白组提高了2．7倍；添加20g／L氧化铝时灰树花胞外多糖产量达到最大，为8．46g／L，为空白组的1．7倍左右，而菌丝体多糖产量以添加0．1g／L氧化铝时最高，为65．6mg／g。

关键词：

灰树花；氧化铝；菌丝体形态；胞外多糖

灰树花又名贝叶多孔菌，栗子蘑等，日本俗称“舞茸”［1］，具有免疫调节、抗肿瘤、抗HIV、降血糖等功效［2－3］。液体发酵技术具有培养周期短、产品质量稳定、生产胞外活性产物等优势，因此，灰树花发酵过程优化和调控也获得了国内外学者广泛关注［4－5］。丝状真菌是多细胞结构，主要以顶端延长方式进行生长。在丝状真菌的液体发酵过程中，菌体形态是一项重要的工艺参数，与发酵醪的流变特性、传质特性、目的产物的积累密切相关［6］，因此，研究真菌菌体形态及其调控策略是当前热点之一［7］。通常，深层发酵过程中，真菌多以球状菌丝体、团簇状菌丝体和游离菌丝体等3种形态存在。其中，球状菌丝体为球形的较为稳定、规则的菌丝聚集体，而团簇状菌丝体的聚集机制与类型则具有非规则性和随机性，丝状真菌的菌体形态由环境和基因组共同决定［8］。研究表明，小粒径的颗粒物质（微粒子）可通过阻碍菌丝聚集等作用改变菌体形态［9］，故添加微粒子控制丝状真菌菌体形态和增强其发酵产物的产量也成为近期研究热点之一［10］。比如DRIOUCH等发现，添加25g／L粒径为8μm的金属钛氧化物TiSiO4，黑曲霉的菌球直径由1．7mm减小到了0．3mm，且所产的呋喃果糖苷酶和葡萄糖淀粉酶活力分别提高了3．7倍和9．5倍［11］。由于氧化铝粒径小、硬度高、难溶于水，并且无毒无臭，也已应用于改善多种丝状真菌菌体形态和发酵性能。例如，KAUP等通过添加一定粒径的Al2O3来调控海洋真菌的形态和过氧化物酶的产量［9］。笔者在前期研究的基础上，使用添加不同浓度Al2O3培养基发酵灰树花，考察菌丝体形态、菌丝体生物量及胞内和胞外粗多糖产量，以期了解微粒子对食药用真菌深层发酵过程中菌丝体生长和产物合成的影响。

1材料与方法

1．1供试菌株与培养基

灰树花菌株CS－15由江苏大学生物工程实验室保存。菌种培养基（g／L）：20葡萄糖，5蛋白胨，1．5磷酸二氢钾，0．75七水硫酸镁。发酵培养基（g／L）：30葡萄糖，6蛋白胨，3磷酸二氢钾，1．5七水硫酸镁。

1．2试剂与仪器设备

Al2O3（200～300目）购自阿拉丁试剂有限公司，使用10mL醋酸钠缓冲液（50mmol／L，pH6．5）配制成300g／L的Al2O3悬浮液。葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、醋酸钠等试剂均为分析纯。体视显微镜为奥林巴斯株式会社产品，真空冷冻干燥机为北京博医康仪器设备有限公司产品。

1．3液体发酵

灰树花试管种经PDA平板活化（28℃培养5d），取10块5mm×5mm的菌块接种于装有100mL液体菌种培养基的250mL三角瓶内，28℃、150r／min培养3d，制得种子液。发酵培养基添加Al2O3悬浮液至Al2O3终浓度0．1、0．5、1、3、6、10、15和20g／L，500mL三角瓶装供试培养基140mL，接种10％液体种子液，28℃、150r／min条件下培养3d。发酵结束后，取样分析灰树花菌丝体形态分布，测定菌丝体生物量、胞外多糖和菌丝体多糖产量。每个处理设3个重复。

1．4菌丝体形态的观察

收集灰树花发酵菌丝体，蒸馏水洗涤后置于平板中，采用数码相机及体视显微镜拍照取像。根据菌丝体当量直径（与对象具有相等面积的圆形的直径）大小将菌丝体形态分为L（D≥1．5cm）、M（0．5cm≤D＜1．5cm）和S（D＜0．5cm）型。

1．5菌丝体生物量的测定

取发酵醪，8000g离心20min，上清液备用；将收集的菌丝体过300目尼龙筛，用蒸馏水反复洗涤菌丝体去除氧化铝［12］，菌丝体冷冻干燥，称重。

1．6粗多糖的提取

胞外粗多糖提取：取1．5中离心后的上清液，旋转蒸发浓缩至原体积的1／5左右，加入4倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜，10000g离心10min，沉淀冷冻干燥至恒重，既得胞外粗多糖。菌丝体粗多糖提取：取冻干后的菌丝体，匀浆机打碎，90℃热水（料液比1∶25，w／v）提取2h［13］，10000g离心20min，将提取液旋转蒸发浓缩至原体积的1／3左右，加入4倍体积无水乙醇，沉淀、离心和冻干同胞外粗多糖制备，得菌丝体粗多糖。

1．7数据处理

实验数据采用SPSS10．0软件进行处理。图和表中结果为3个重复的平均值±标准偏差。采用one－wayANOVA进行试验数据的方差分析，P＜0．05表示差异显著。2结果与分析2．1Al2O3添加量对灰树花菌丝体形态分布的影响Al2O3添加浓度对灰树花菌丝体形态变化和大小分布的影响如图1和图2所示。空白对照组中菌球直径较大，主要在0．8～2．0cm之间，且菌球四周有刺状绒毛，此时L型与M型菌丝体的含量相当，分别为45．4％和49．8％。Al2O3添加量为0．1g／L和0．5g／L时，直径0．6～1．0cm的菌球开始增多且绒毛明显，菌丝体松散，呈放射状。随着Al2O3浓度的增加，菌球直径逐渐变小，M型与S型菌丝体的比例增加，而L型菌丝体的含量却相应减少。Al2O3浓度为1．0g／L时，M型菌丝体比例达到最高，为58．7％，略高于0．5g／L中的57．2％。6．0g／L时出现了扁长状的游离菌丝体，菌球也更为紧实。当Al2O3添加浓度为20．0g／L时，菌丝体主要表现为较小的菌球和游离菌丝体，其中菌球中L型菌丝体所占比例仅为4．9％，且菌丝体表面吸附了大量的Al2O3，而S型菌丝体比例高达70．8％。

2．2Al2O3添加量对菌丝体生物量及多糖产量的影响

不同Al2O3添加量对灰树花菌丝体生物量、胞内外多糖产量的影响见图3。空白对照组中菌丝体生物量最低，为2．13g／L，随着Al2O3添加浓度的增加，菌丝体生物量也增加，并在3g／L时达到最大值5．81g／L，约为空白对照的2．7倍。然而高浓度的Al2O3对生物量并没有持续增加的作用，反而导致了生物量的降低，Al2O320g／L时菌丝体生物量为2．35g／L，略高于对照组。由此可见，适宜浓度的Al2O3对灰树花的菌丝体生长具有明显的促进作用，但是较高的浓度则产生抑制效应。Al2O3添加量为20．0g／L时灰树花胞外多糖产量最高，为8．46g／L；其他添加浓度下，胞外多糖产量与空白对照差异不显著。在Al2O3添加量为0．1g／L和3．0g／L时，灰树花菌丝体多糖产量显著高于其他添加浓度处理组及空白对照组，其中添加量为0．1g／L时，菌丝体多糖产量最高。

3讨论

添加微粒子作为一种新型的丝状真菌形态控制策略，已引起了国内外相关研究者的关注。笔者在灰树花发酵过程中添加同一粒径的不同浓度氧化铝后，灰树花菌丝体形态呈明显的多样化。较高浓度的氧化铝（10～20g／L）促使菌球直径减小，并且生成较多的游离菌丝体甚至短小的菌丝片段。已有的研究结果表明，液体培养时，微粒子与菌丝之间发生碰撞，且加剧了搅拌对菌丝体的剪切作用，阻止或阻碍了菌丝聚集及菌球形成［14］。该结果与高速机械搅拌的效果相似，均能有效控制或者降低菌球的大小。添加微粒子除了在一定程度上调控丝状真菌的菌体形态，也显著影响目的产物的产量。当添加15．0g／L粒径为42μm的Al2O3时，真菌C．fumago的氯过氧化物酶产率显著提高，为空白组的5倍，且酶活达到了1000U／mL［9］；GAO等在深黄被孢霉（Mortierellaisabellina）培养中分别添加0．1～10．0g／L的硅酸镁，随着微粒子浓度的增加，菌体逐渐变小，在10．0g／L时脂肪含量和产率达到最大值，每克菌体干重含脂肪0．75g，每消耗1g葡萄糖产脂肪0．18g，脂肪产量是空白组的2．5倍，此时菌体形态主要为游离菌丝体［15］。在本研究中，适宜浓度的氧化铝对灰树花的菌丝体生长、胞内外多糖的合成也具有一定的促进作用，氧化铝高添加量（20．0g／L）下，游离菌丝体增多，菌丝球主要呈S型，虽生物量较低，但胞外多糖的产量却达到最高值，相比空白组提高了1．7倍，这也表明体积较小的菌丝体其内部的溶氧、传质较为顺利，因而有利于胞外多糖的积累，团块状的大型菌丝体极大限制了氧气、营养物质的传输。因此，添加微粒子为精确调控食药用真菌菌丝体的生长和形态以及产物合成提供了新的思路。

参考文献

［8］熊强，徐晴，顾帅，等．丝状真菌形态控制及其在发酵过程优化中的应用［J］．生物工程学报，2012，28（2）：178－190．

［12］王红，张兰天．食品中铝含量检测方法的研究［J］．食品工业，2012，33（11）：191－194．

［13］茆广华，徐财泉，周晓芬，等．灰树花粗多糖提取和重金属去除工艺［J］．食用菌学报，2010，17（1）：76－79．

作者：陈潇筱 杨焱 崔凤杰 孙文敬 刘伟民 单位：江苏大学食品与生物工程学院 上海市农业科学院食用菌研究所 农业部南方食用菌资源利用重点实验室 国家食用菌工程技术研究中心 国家食用菌加工技术研发中心