破壁方法对酵母内容物提取的影响范文

《农产品加工杂志》2015年第六期

1材料与方法

安琪高活性酵母，安琪酵母股份有限公司产品；蜗牛酶，国药集团化学试剂有限公司产品；溶壁酶，国药集团化学试剂有限公司产品；β-葡聚糖酶，国药集团化学试剂有限公司产品；中性甲醛、NaCl和NaOH等，均为分析纯。NS2006型高压均质机，北京天恩瀚拓科技有限公司产品；JY98-ⅢDN型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；752PC型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；SSW-600-2S型电热恒温水槽，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；5804R型离心机，北京博仪恒业科技发展有限公司产品。氨基态氮的测定采用甲醛滴定法[18]，参照中华人民共和国国家标准GB/T23530—2009（酵母抽提物）。配制适宜质量分数的酵母溶液，考察不同破壁方法在各自最适条件下对酵母破壁的影响[19]。酶法破壁是通过预试验筛选出蜗牛酶、溶壁酶、β-葡聚糖酶3种效果较好的酶后，再通过单因素试验探索3种酶在不同破壁时间、破壁温度和破壁pH值条件下的破壁效果，选出破壁效果更好的酶；高压均质法考察均质压力、均质循环次数以及酵母质量分数3个因素对破壁效果的影响；超声波法破壁超声功率、超声时间和酵母质量分数3个因素对破壁结果的影响；自溶法考察自溶时间、自溶温度、自溶pH值以及自溶促进剂对破壁结果的影响。最后对4种不同破壁方法的结果进行比较分析，筛选出破壁效果最好的一种，并利用正交试验进行优化设计，以期得出该方法下的最佳工艺条件。

2结果与讨论

2.1超声波破壁

2.1.1超声功率对酵母破壁的影响在酵母质量分数为5%，超声时间30min的条件下探究60，70，80，90，100W超声功率下的氨基氮得率，从而确定最佳超声功率。由图1可知，随着超声功率的不断增加，氨基态氮得率也随之不断增加。因为超声波是通过纵波不断对细胞进行冲击来达到对细胞壁的破碎效果。因此，功率越高对细胞的破碎效果也就越好，故超声功率在100W时为最佳，此时氨基氮含量可达0.060g/100mL，约占酵母干质量的1.10%。

2.1.2超声时间对酵母破壁的影响酵母质量分数5%，超声功率100W的条件下，通过检测氨基氮得率来确定最佳超声时间。超声时间对酵母破壁的影响见图2。由图2可知，随着超声时间的增加，氨基氮得率呈现不断上升趋势，在超声时间25~30min，氨基氮的得率变化随着时间增加而变大；在超声时间35~40min，氨基氮的得率变化趋于平缓。因为超声时间达到一定程度后，在该条件下的酵母破壁效果已经达到了最佳，再延长超声时间也对破壁效果没有明显促进作用，故超声时间可确定为35min。在该条件下的氨基氮含量可达0.063g/100mL，约占酵母干质量的1.15%。

2.1.3酵母质量分数对酵母破壁的影响在超声功率100W，超声时间35min的条件下，探索超声破壁的最佳酵母质量分数。酵母质量分数对酵母破壁的影响见图3。由图3可知，随着酵母质量分数的增加，氨基氮得率也不断增加，但在酵母质量分数达到5%后，增加趋势明显缓慢，可能是由于酵母质量分数过高，达到超声波所能处理的最大酵母细胞数量。因此，选择5%的酵母质量分数进行超声波破壁最为合适，氨基氮含量可达0.064g/100mL，约占酵母干质量的1.16%。

2.2酶法破壁

酶法破壁是目前较为广泛采用的破碎细胞壁方法之一，而且破壁效果相对来说也较理想。因此，本节将探索不同来源的酶对酵母破壁效果的影响。选取破壁中3种比较常见的破壁酶进行试验，分别为溶壁酶、蜗牛酶和β-葡聚糖酶。在各自的最适温度、pH值条件下，进行酶解破壁。以氨基氮得率为指标，结果表明蜗牛酶的破壁效果最好。因此，选择蜗牛酶进行单因素试验。

2.2.1蜗牛酶破壁时间对酵母破壁的影响在蜗牛酶破壁温度、蜗牛酶添加量等条件固定的情况下，探索蜗牛酶破壁时间对酵母破壁的影响。蜗牛酶破壁时间对酵母破壁的影响见图4。随着破壁时间推移，氨基氮的得率呈上升趋势，但超过7h后，上升趋势趋于缓和，再延长破壁时间对破壁效果影响不大，反而降低了效率。因此，破壁时间在7h为宜，此时氨基氮含量可达0.104g/100mL，约占酵母干质量2.04%。

2.2.2蜗牛酶破壁温度对酵母破壁的影响向酵母液中加入10mg/mL的蜗牛酶，调节pH值为5.0，蜗牛酶破壁7h，探索在40，45，50，55，60℃的不同温度条件下蜗牛酶的破壁效果。蜗牛酶破壁温度对酵母破壁的影响见图5。由图5可知，在40~55℃下，随着蜗牛酶破壁温度的升高，氨基氮得率也随之增加，但超过55℃后氨基氮得率呈现下降趋势。可能是由于超过蜗牛酶的最适反应温度后，蜗牛酶的活性减弱，导致破壁效率也减弱。因此，蜗牛酶破壁温度选取55℃为宜，此条件下氨基氮含量最高可达0.089g/100mL，约占酵母干质量1.74%。

2.2.3蜗牛酶添加量对酵母破壁效果的影响在蜗牛酶破壁温度55℃，破壁pH值5.0的条件下蜗牛酶破壁7h，得到不同添加量条件下的蜗牛酶对酵母破壁效果的影响。蜗牛酶添加量对酵母破壁效果的影响见图6。由图6可知，蜗牛酶添加量在6~10mg/mL时，氨基氮得率随着蜗牛酶添加量的增加而显著增加；但到超过10mg/mL后氨基氮得率增加不明显，达到14mg/mL时，已趋于平缓。综合效益考虑，10mg/mL的蜗牛酶添加量较为合适。结合上述试验可以得出，在蜗牛酶破壁温度55℃，破壁pH值5.0，破壁时间7h，蜗牛酶添加量10mg/mL时破壁效果相对较好，游离氨基氮含量最高可达到0.091g/100mL，约占酵母干质量1.74%。

2.3高压均质破壁法破壁

在机械破壁法中，高压均质法相对来说破壁效果比较好，通过预试验发现，单次破壁效果一般，需多次循环破壁才能达到较好效果。

2.3.1酵母质量分数对高压均质破壁的影响在均质压力90MPa，均质循环次数3次的条件下，配制酵母质量分数1%，2%，3%，4%，5%进行高压均质破壁。酵母质量分数对酵母破壁的影响见图7。由图7可知，随着酵母质量分数增加，氨基氮得率也呈上升趋势，到4%后增加趋势变缓，4%~5%得率增加不明显，5%质量分数下氨基氮含量最高为0.063g/100mL。

2.3.2均质压力对酵母破壁效果的影响配制酵母质量分数5%，在50，60，70，80，90MPa的条件下分别循环3次得到的氨基氮含量。均质压力对酵母破壁的影响见图8。由图8可知，随着均质压力增加，氨基氮得率呈不断上升趋势，但由于设备条件工作压力最高为90MPa左右。因此，考虑设备的条件下选择90MPa的均质压力，在该条件下氨基氮含量可达0.075g/100mL，占酵母干质量约1.34%。

2.3.3均质循环次数对酵母破壁效果的影响配制酵母质量分数5%，调整均质压力90MPa，在该条件下分别循环1~5次。由图9可知，随着均质循环次数的增加，氨基氮得率也随着增加，循环4次后，增加趋势变缓。为简化工艺，均质循环次数4次为宜。该条件下氨基氮含量可达0.067g/100mL，占酵母干质量1.20%。

2.4自溶法破壁

酵母自溶是酵母在特定的温度和pH值等条件下，触发了细胞能消化自身结构的自溶酶分解作用所产生的一种自我分解现象。正常情况下，健壮的酵母胞内酶不会外泄，在不利的环境（如温度较高、营养缺乏等）下，酵母活力下降、衰老以至死亡，酵母细胞自身的各种水解酶类（如蛋白水解酶、核糖核酸酶、腺苷酸激酶等）作用于各自相应的特定底物，从而发生细胞的自我分解作用。相对于其他破壁方法，自溶法破壁虽然时间消耗比较久，但破壁效果更好，氨基氮得率高，且没有复杂的后续处理工序。

2.4.1自溶时间对自溶法破壁的影响配制一定质量分数的酵母溶液，在自溶pH值和自溶温度一定的情况下，加入3%的NaCl，分别自溶22，24，26，28，30h，得到的氨基氮含量。由图10可知，在22~26h时氨基氮得率显著增加，超过26h后在26~28h时增加很缓慢，28h以后氨基氮得率呈现下降趋势。可能是由于自溶趋向完全后，随着自溶时间推移，氨基酸被进一步分解，分解的速度超过溶出的速度。因此，综合考虑自溶时间26h为宜，在此条件下得到的氨基氮含量最高可达0.125g/100mL，约占酵母干质量的2.25%。

2.4.2自溶pH值对自溶法破壁的影响影响酵母自溶的因素很多，自溶pH值在这些因素中作用又更加明显。为此，在一定自溶温度、自溶时间和NaCl的条件下，探索自溶的适宜pH值。氨基氮得率随着自溶pH值增加呈现先增加后降低的趋势，在自溶pH值为5.0时达到最高值，自溶pH值超过5.0后氨基氮得率呈现显著下降趋势。因此，自溶pH值在5.0时比较合适，在此自溶pH值条件下氨基氮含量可达0.122g/100mL，占酵母干质量2.18%。

2.4.3自溶温度对自溶法破壁的影响自溶温度作为一个重要的因素，在自溶中有着不可忽视的作用。在自溶pH值5.0，自溶时间26h的条件下，配制5%的酵母溶液，分别在不同温度下自溶。自溶温度对酵母破壁的影响见图12。由图12可知，从40℃开始，氨基氮溶出率随着自溶温度升高而不断增加，在50℃时达到最大值，而且此时酵母抽提液的风味也相对较好。但自溶温度超过50℃后，氨基氮溶出率迅速下降。可能过高的温度对酵母本身的水解酶类产生了破坏，导致自溶效果下降，氨基氮溶出率也降低。所以，在50℃时自溶效果最好，在该温度下氨基氮溶出率可占酵母干质量的2.07%。

2.4.4自溶促进剂对自溶法破壁的影响在酵母自溶的过程中，除了自溶温度、自溶pH值、自溶时间等这些因素对自溶的结果有很大影响外，自溶促进剂也在这方面起着很大的作用，它通过改变酵母细胞的渗透性，诱导细胞内的自溶酶在特定条件下进行细胞的自我分解，从而加速自溶作用。自溶促进剂不仅能提高自溶的效率，还能增加酵母抽提物的得率和氨基氮的得率。在自溶温度50℃，自溶时间26h的条件下，调节自溶pH值至5.0，分别加入不同的自溶促进剂促进自溶。自溶促进剂对酵母破壁的影响见图13。由图13可知，添加NaCl的效果最好，氨基氮的得率最高；其他几种自溶促进剂中乙醇效果其次，半胱氨酸效果最差。因此，选择NaCl作为自溶破壁的促进剂，经过试验得出3%左右NaCl的效果最好，此时的氨基氮得率最高，达到2.04%，约0.115g/100mL。

2.5自溶法正交试验

通过对以上几种破壁方法在各自最佳条件下的破壁效果分析可得，自溶法破壁的效果明显比其他几种方法效果更好。在自溶温度50℃条件下，调自溶pH值5.0，加入3%的NaCl自溶26h得到的氨基氮含量最高可达0.125g/100mL，约占酵母干质量的2.25%。与高压均质法破壁的氨基氮得率1.34%及超声波破壁的氨基氮得率1.16%相比较，自溶破壁效果更好，而且比酶法破壁的氨基氮得率2.04%也有明显的提升。因此，本文采取自溶法为破壁手段，利用正交试验设计方法对自溶法破壁的几种条件进行优化，获取其最佳的工艺条件。

2.5.1正交试验正交试验的因素与水平设计见表1。以A，B，C为自变量，氨基氮得率为应变量。正交试验分析结果与分析见表2。表中K1，K2，K3分别表示氨基氮在各因素水平下的平均提取量（由于有时会遇到各因素水平数不等的情况，因此一般用平均值大小来反映同一个因素的各个不同水平对试验结果的影响大小。同时，同一因素水平下平均提取量的极差值R（R=Kmax-Kmin）则用来反映各因素水平变化对试验结果影响的大小。由表中的极差分析结果可以看出RA>RB>RC，说明3个因素中对自溶的影响大小依次为A>B>C。在自溶过程中，自溶时间和自溶温度对自溶破壁的影响效果要明显大于自溶pH值，其中自溶时间的影响又最为显著。因此，在正交试验范围内优化得到自溶法破壁的最佳条件为A2，B2，C2，即自溶温度50℃，自溶pH值5.0，自溶时间26h。

2.5.2验证试验按照上述正交试验得出的优化结果A2，B2，C2，进行3次平行试验，得到氨基氮的平均含量为0.114g/100mL，约占酵母干质量2.27%，大于正交试验中的最大值2.13%。因此，利用正交试验优化自溶法破壁条件是成功的。

2.5.3正交试验方差分析正交试验直观分析法简便直观，但不能估算试验误差，不能区分试验结果的差异是由各因素的水平变化还是由随机波动而导致的。为此，可以对正交试验结果作方差分析。在设计正交试验时，作一个空白列。由于空白列中没有因素作用，所以刚好能够反映随机因素引起的误差。由表3可知，因素A（p<0.05）对试验结果的影响显著；因素B（p<0.05）试验结果的影响显著；因素C（p>0.10）对试验结果有一定影响。因此，因素A和B为主要因素，C相对于A，B来说影响较小。对主要因素选择最佳水平后，次要因素可依据实际选择适合水平。综合考虑得到自溶破壁最佳条件为A2，B2，C2，即自溶温度50℃，自溶pH值5.0，自溶时间26h。

3结论

在对酵母的不同破壁方法进行试验探索后，可以发现，超声波法、高压均质法、酶法和自溶法都有各自的优点与不足。但综合考虑，自溶法的破壁效率相对较好，与其他方法相比较，更适合工业化生产。通过对自溶法的正交优化试验得出，自溶法破壁可选择自溶温度50℃，自溶pH值5.0，在此条件下再根据实际情况选择自溶时间。上述试验得出的自溶时间条件为26h，但由于是相对于其他因素来说对氨基氮的影响没有那么重要，延长一段时间可能还能让氨基氮的得率进一步提升。所以，在以后对酵母不同破壁方法研究中还可以尝试选择不同时间来进行自溶破壁，同时通过此次试验初步得到了一个相对较好的自溶法破壁条件，也为以后获得更优的破壁工艺条件提供了一定线索，从而取得较好的效益。

作者：徐那秦丹蔡水淋刘智禹单位：湖南农业大学食品科学技术学院福建省水产研究所